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Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 16730 (2022) Citar este artículo
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Varios estudios recientes han establecido la eficacia de la terapia de fotobiomodulación (PBMT) en condiciones clínicas dolorosas. La neuropatía diabética (DN) puede estar relacionada con la activación de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK), como p38, en el nervio periférico. La vía MAPK se activa en respuesta a estímulos extracelulares, incluidas las interleucinas TNF-α e IL-1β. Verificamos el potencial de alivio del dolor de PBMT en ratas neuropáticas diabéticas inducidas por estreptozotocina (STZ) y su influencia en la regulación de la vía MAPK y la dinámica del calcio (Ca2+). Luego observamos que PBMT aplicado a la región del ganglio de la raíz dorsal (DRG) L4-L5 redujo la intensidad de la hiperalgesia, disminuyó los niveles de TNF-α e IL-1β y la expresión del ARNm de p38-MAPK en DRG de ratas neuropáticas diabéticas. DN indujo la activación de MAPK p38 (p-38) fosforilada co-localizada con neuronas TRPV1+; PBMT impidió parcialmente la activación de p-38. La ND se relacionó con un aumento de la expresión de p38-MAPK debido a las interleucinas proinflamatorias, y el tratamiento con PBMT (904 nm) contrarrestó esta condición. Además, la sensibilización de las neuronas DRG por la condición hiperglucémica demostrada durante la dinámica de Ca2+ fue reducida por PBMT, lo que contribuyó a sus efectos antihiperalgésicos.
La diabetes puede dañar el sistema nervioso periférico (SNP) de varias maneras, y la neuropatía diabética (ND) es una de las complicaciones más comunes de la diabetes no tratada1. La ND es un trastorno crónico complejo que afecta los nervios periféricos, provocando un cuadro doloroso que involucra a los miembros superiores e inferiores1,2,3,4 con una incidencia de alrededor del 70% de los pacientes diabéticos5,6. El mecanismo por el cual la hiperglucemia conduce a la lesión de los nervios periféricos no está muy claro, pero se sabe que varias vías metabólicas se ven afectadas7. Los principales eventos involucran la vía de los polioles, a través de la activación de la aldosa reductasa (AR)8,9,10,11, la glicosilación de proteínas y la producción de productos finales de glicación avanzada (AGE)10,12,13. Además, la formación de radicales libres ligada al estrés oxidativo14,15, el soporte neurotrófico reducido16,17 y el aumento de la activación de la proteína quinasa C (PKC)9,18 contribuyen al daño periférico. Como resultado del desequilibrio metabólico, la falla mitocondrial10,19,20 y los procesos inflamatorios también son frecuentes y están relacionados con la fosforilación de las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK)21,22,23,24,25.
MAPK es una familia de serina/treonina proteína quinasas responsables de transducir estímulos extracelulares en respuestas postraduccionales y transcripcionales intracelulares26,27,28. Comprende p38-MAPK, proteína quinasa regulada por señal extracelular (ERK1/2) y c-Jun N-terminal quinasa/proteína quinasa activada por estrés (SAPK/JNK)29. Las tres subfamilias principales de MAPK (p38, ERK1/2 y JNK) coordinan varias funciones: transcripción de genes, síntesis de proteínas, ciclo celular, proliferación, diferenciación y apoptosis30,31,32,33. Los estímulos extracelulares, como las citoquinas proinflamatorias34,35,36 y el estrés oxidativo30,37 pueden activar la vía MAPK, también bajo la influencia de la dinámica del Ca2+38,39. La despolarización de la membrana puede promover la entrada de calcio a través de los canales de calcio de tipo L y activa MEK1, que fosforila MAPK39. La hiperglucemia parece ser uno de los factores que podría estimular la fosforilación de MAPKs40,41, una vez que se ha visto la activación de p38 en neuronas sensoriales periféricas de ratas diabéticas42, concretamente en los ganglios de la raíz dorsal (GRD)43,44,45,46. De manera similar, la fosforilación de JNK conduce a la apoptosis de las neuronas estresadas por hiperglucemia a través de la activación de caspasa-322,47,48,49. Además, la señalización de MAPK estimula la expresión del receptor potencial transitorio vaniloide subtipo 1 (TRPV1) en el dolor crónico, un canal altamente permeable al Ca2+50. Esto implica varias complicaciones de la diabetes, incluida la hiperalgesia térmica51.
Debido a la complejidad de las alteraciones metabólicas observadas en la ND, existen varias dianas farmacológicas para el tratamiento del cuadro doloroso, pero con baja eficacia. La mayoría de los pacientes refiere cierto alivio de los síntomas, pero este retrocede con el tiempo, incluso antes de finalizar el tratamiento52. Caracterizada como un proceso no térmico, la terapia de fotobiomodulación (PBMT) implica la activación de cromóforos celulares específicos, como la citocromo c oxidasa (CCO; complejo mitocondrial IV) con irradiación roja e infrarroja53. Este proceso es desencadenado por reacciones fotofísicas y fotoquímicas en el interior de las células cuando la luz atraviesa la membrana celular54,55,56, provocando la modulación de vías específicas relacionadas con la supervivencia celular, como el aumento del trifosfato de adenosina (ATP), la producción de oxígeno y liberación de óxido nítrico (NO)57. En consecuencia, la fotobiomodulación puede utilizarse como terapia para tratar algunas condiciones dolorosas58,59,60,61,62,63,64,65 incluyendo la ND, al menos complementaria, como se observó en un estudio previo realizado por nuestro grupo66. En base a eso, este estudio tuvo como objetivo analizar los efectos antihiperalgésicos de PBMT (904 nm) en la neuropatía diabética inducida por estreptozotocina (STZ), considerando el papel de la vía MAPK en el curso de la enfermedad y como objetivo para el PBMT. mecanismo.
El protocolo de inducción de DT1 a través de dosis bajas de STZ (cinco dosis bajas, una dosis única de 25 mg/kg por día) fue adecuado para la instalación de hiperglucemia irreversible. Todas las ratas sometidas a inyecciones de STZ (grupos STZ y STZ + PBMT) se volvieron hiperglucémicas (≥ 250 mg/dL de concentración de glucosa en sangre; 349,07 ± 48,23 mg/dL) después de cinco dosis bajas de STZ, alcanzando el umbral de hiperglucemia entre la cuarta y quinto día (Fig. 1A,B). Las ratas hiperglucémicas también presentaron poliuria, polifagia y polidipsia (datos no mostrados). Dejaron de ganar peso, con una ligera pérdida de peso (en gramos) a lo largo del período experimental (Fig. 1C). La administración sistémica de tampón de citrato de sodio (SCB), el vehículo STZ, no alteró la glucemia ni el aumento de peso en comparación con las ratas de control sin tratamiento previo.
PBMT disminuye la hiperalgesia de las ratas T1D sin cambiar su glucemia o peso. (A) Glicemia matutina promedio (línea roja) de ratas durante el protocolo de inducción de T1D por múltiples dosis bajas de STZ; línea negra horizontal punteada: umbral de diabetes establecido (glucosa ≥ 250 mg/dL). (B) Las ratas de los grupos STZ (línea roja) y STZ + PBMT (línea verde) mostraron altos niveles de hiperglucemia a los 7, 14, 21, 24 y 28 días. (C) Las ratas de los grupos STZ (línea roja) y STZ + PBMT (línea verde) dejaron de aumentar de peso después de la instalación de la diabetes. (D) Los datos de los umbrales de retiro mecánico (Δ; g; la intensidad de la hiperalgesia) muestran que PBMT redujo significativamente la intensidad de la hiperalgesia del grupo STZ + PBMT (línea verde) en comparación con el grupo STZ (línea roja), al 24 y 28 días. (E) Gráfico de barras que destaca el efecto antihiperalgésico de PBMT durante el período comprendido entre los días 21 y 28. En (A–C), el símbolo (***) significa una diferencia significativa (p < 0,001) entre los grupos de diabéticos y los controles (ANOVA de dos vías seguido de la prueba posthoc de Bonferroni). En (D) y (E), los símbolos (**) y (***) significan una diferencia significativa (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) entre los grupos STZ y STZ + PBMT (ANOVA de dos vías seguido de Bonferroni posthoc prueba); el símbolo (#) significa una diferencia significativa (p < 0,001) entre los grupos inducidos por STZ en comparación con los grupos de control (ANOVA bidireccional seguido de la prueba posthoc de Bonferroni [D]; ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Bonferroni [E]). Los datos se expresan como media ± SEM; las líneas negras punteadas verticales indican el período PBMT.
STZ es un antibiótico diabetogénico conocido por su capacidad selectiva para destruir las células beta pancreáticas (células β), comúnmente utilizado para el modelo de DT1 en ratas67,68,69,70. La STZ es captada por el transportador de glucosa de las células β GLUT2 y desencadena mecanismos inmunitarios68,69. Según Wang y Gleichmann68,69, STZ restringe la expresión de GLUT2 in vivo e in vitro cuando se administra a través de múltiples protocolos de dosis bajas, que es un método que tiene como objetivo producir menos efectos secundarios de STZ, como la neurotoxicidad. En general, las ratas sometidas a inyecciones de STZ muestran déficits en la producción de insulina, lo que conduce a hiperglucemia y, en consecuencia, polidipsia y poliuria70. Todas esas señales de diabetes se observaron en ratas sometidas al protocolo STZ a dosis bajas (grupos STZ y STZ + PBMT), caracterizando así un modelo reproducible de inducción de diabetes, como se muestra en estudios previos de nuestro grupo66,71,72,73,74 .
Las ratas diabéticas, sometidas o no a PBMT (grupos STZ + PBMT y STZ, respectivamente), mostraron niveles similares de hiperglucemia en los días 21, 24 y 28 del protocolo experimental (454,94 ± 37,10 mg/dL). Lo mismo se observó con respecto al peso de las ratas, ya que este parámetro solo dependía de la condición diabética y no de la PBMT. De la misma manera, PBMT no causó ninguna influencia sobre ratas sanas (control, no diabéticas y no hiperalgésicas; grupo SCB + PBMT), como se muestra en las Fig. 1B,C. Nuestros resultados corroboran con el estudio realizado por Peplow y colaboradores75, en el que PBMT (660 nm; 100 mW; 4,7–6,3 J/cm2; 20 s) aplicado para la cicatrización de heridas en pacientes diabéticos no modifica la hiperglucemia ni el estado metabólico de los pacientes .
Los datos reprodujeron resultados previos obtenidos de nuestro grupo de investigación66. En el día 21 (después de la primera sesión de PBMT), no hubo reducción en la intensidad de la hiperalgesia mecánica (Δ umbral de retiro, g). Sin embargo, en los días 24 y 28, se observó una reducción significativa en el tiempo (p < 0,01 y p < 0,001, respectivamente) en la intensidad de la hiperalgesia en el grupo STZ + PBMT en comparación con el grupo STZ. No obstante, cuando se aplicó PBMT a ratas de control (grupo SCB + PBMT), no hubo cambios en los umbrales de retiro mecánico en una condición similar observada en los grupos SCB (vehículo) y Naïve, como se muestra en la Fig. 1D, E (el último en detalle para el período PBMT).
El PBMT se ha utilizado durante mucho tiempo para el tratamiento clínico del dolor neuropático con resultados satisfactorios76,77, pero sus mecanismos analgésicos no se conocen por completo. La inhibición de la hiperactividad neuronal por la luz infrarroja parece ser una de las formas en que el PBMT actúa directamente sobre las neuronas78,79 y, en consecuencia, sobre los resultados del dolor. Se ha sugerido un efecto de neuromodulación porque los pacientes con dolor de espalda sometidos a PBMT (808 nm; 100 mW; 8,4 J; 84 s; una sola sesión) en los niveles L4-L5 presentan un alivio significativo del dolor52,80. Este efecto modulador podría ser la clave para regular la actividad neuronal afectada por la hiperglucemia evitando la sensibilidad dolorosa.
Nuestro análisis se basó en un estudio previo que identificó alteraciones de la función motora dinámica relacionadas con DN74 inducida por STZ. Como se muestra en la Fig. 2A,B, PBMT pudo mejorar el Área de contacto máxima (cm2) y el Área de impresión (cm2) de las patas traseras de las ratas después de 4 (día 24) y 8 (día 28) sesiones de PBMT. Probablemente, estos datos sugieren que una mejoría de la analgesia debería mejorar la conducción nerviosa. Se observaron diferencias estadísticas entre los grupos STZ + PBMT y STZ en dichos períodos. Sin embargo, no se observó diferencia en el parámetro Longitud de zancada (cm) (fig. 2C), excepto entre ambos grupos neuropáticos (STZ y STZ + PBMT) frente a los grupos de control (Naïve, SCB y SCB + PBMT). Las áreas de los dedos y almohadilla plantar (glabras) aparecieron bien delimitadas en las huellas de la pata trasera derecha (RH) de ratas del grupo STZ + PBMT los días 24 y 28 (Fig. 2D: e), que eran similares a las observado en los grupos Naïve y SCB (Fig. 2D: a, b, d), diferenciándose así del grupo STZ (Fig. 2D: c). El último mostró una reducción en el área de contacto con una baja resolución de las huellas en el día 28.
Los parámetros espaciales de la marcha fueron alterados en DN y frustrados por PBMT. (A) Área Máxima de Contacto (cm2). (B) Área de impresión (cm2). (C) Longitud de zancada (cm). Los datos se expresan como media ± SEM; los símbolos (*) y (***) significan diferencia significativa (p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente) entre los grupos STZ y STZ + PBMT; el símbolo (#) significa diferencia significativa (p < 0,001) entre los grupos inducidos por STZ (STZ y STZ + PBMT) en comparación con los grupos de control (Naïve; SCB; SCB + PBMT); ANOVA de dos vías seguido de la prueba posthoc de Bonferroni. (D) El patrón general de las huellas 2D de la pata trasera; las ratas del grupo STZ (c) mostraron una reducción en el área de contacto, delimitada por la línea de puntos blanca e indicada por las flechas rojas; las ratas del grupo STZ + PBMT (e) presentaron un área de huella más cercana a los grupos de control (flechas rojas). En el marco inferior derecho (f), Body Axis sirve como referencia para observar el posicionamiento de la pata durante el análisis.
Según Zochodne et al.81, la diabetes no controlada conduce al daño de las neuronas sensoriales antes que a las motoras. La DN se asocia a cambios posturales en este proceso, implicando la alteración del posicionamiento del pie durante la marcha82 y alteraciones en la presión aplicada durante la fase de bipedestación83,84. Nuestro grupo demostró que la Intensidad Máxima (au) fue el principal parámetro alterado a los 14 días de iniciar las inyecciones de STZ74, lo que concuerda con resultados previos de otros grupos84. Los animales diabéticos, que presentaron una disminución en el umbral mecánico al día 14, aplicaron menos presión durante el contacto de las patas con el piso de vidrio del sistema CatWalk XT. Estos hallazgos siguen el patrón de cambios sensoriales en la ND, también conocida como "media y guante", que se presenta como un trastorno sensorial de las extremidades de los miembros, comprometiendo la funcionalidad2,85.
Pocos estudios evaluaron la influencia de PBMT en los parámetros motores en modelos animales, principalmente cuando se utilizó el sistema CatWalk XT. La mionecrosis local inducida por veneno de serpiente provoca una postura semi-inflexa de la pata trasera afectada 3 h después de la inyección del veneno. Sin embargo, la PBMT aplicada en el mismo período usando el láser de GaAs (904 nm; 4 J/cm2) devuelve la Intensidad Máxima (ua), el Soporte (s) y el Equilibrio (s) a valores similares al control60. Aunque las ratas hiperglucémicas no presentaron una semiflexión de las extremidades traseras, aplicaron menos presión (representada por una menor intensidad y un área de contacto de la pata más pequeña) durante la marcha. Por lo tanto, PBMT podría normalizar, al menos en parte, la marcha alterada de ratas hiperglucémicas como consecuencia de un efecto antihiperalgésico promovido por esta terapia. En conjunto, es plausible sugerir que el dolor neuropático derivado de la diabetes probablemente se deba al deterioro de las neuronas sensoriales y motoras.
Para investigar más a fondo si el efecto antihiperalgésico de PBMT podría estar asociado con la reducción de citocinas en DRG, analizamos las concentraciones de TNF-α, IL-1β, IL-6, CINC-1 e IL-10 mediante inmunoensayo ELISA. Como se muestra en la Fig. 3B, E, la hiperglucemia aumentó el nivel de IL-1β e IL-10, respectivamente, mientras que no afectó a TNF-α, IL-6 y CINC-1 (paneles A, C y D, respectivamente). Sin embargo, el PBMT disminuyó todas las citocinas analizadas independientemente de la hiperglucemia (fig. 3). De acuerdo con nuestros hallazgos, la hiperglucemia aumenta especialmente el nivel de la citoquina proinflamatoria IL-1 β y la citoquina antiinflamatoria IL-10 en DRG10. Además, los niveles de TNF-α, IL-6 y CINC-1 no se vieron afectados por la hiperglucemia, lo que sugiere un fondo inflamatorio puro en ND. Sin embargo, este estudio no analizó otros parámetros inflamatorios, como la migración de células polimorfonucleares. Sin embargo, los datos de este estudio demostraron que PBMT disminuyó el nivel de citocinas en DRG, incluidas las aumentadas por la hiperglucemia.
Efectos de PBMT sobre los niveles de DRG de TNF-α, IL-1β, IL-6, CINC-1 e IL-10. (A) No hubo aumento en los niveles de TNF-α (pg/mL) en el grupo STZ (símbolos rojos); el grupo STZ + PBMT (símbolos verdes) mostró una reducción significativa en los niveles de TNF-α (pg/mL) en comparación con todos los demás grupos. (B) Para los niveles de IL-1β (pg/mL), hubo un aumento significativo en el grupo STZ (símbolos rojos) en comparación con todos los demás grupos. (C) Los niveles de IL-6 (pg/mL) se redujeron significativamente en los grupos SCB + PBMT (símbolos azules) y STZ + PBMT (símbolos verdes), en comparación con todos los demás grupos. (D) Las concentraciones de CINC-1 (pg/mL) mostraron una reducción significativa solo en el grupo SCB + PBMT (símbolos azules). (E) Los niveles de IL-10 (pg/mL/mg) mostraron un aumento significativo en el grupo STZ (símbolos rojos) en comparación con todos los demás grupos. Los datos se expresan como media ± SEM; los símbolos (*) y (**) significan p < 0,05 y p < 0,01, respectivamente; el símbolo (#) significa que todos los grupos de control son significativamente diferentes del grupo STZ (p < 0,05); ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Bonferroni.
Aunque la fisiopatología del dolor neuropático depende de cada tipo de neuropatía, el uso de PBMT (660 nm; 30 mW; 9 J/cm2; 60 s; 7 días consecutivos; 63 J/cm2 de densidad energética acumulada) en la hiperalgesia inducida por nervio ciático El modelo de constricción provoca una reducción de las citocinas proinflamatorias, como TNF-α, IL-1β y HIF-1α (factor inducible por hipoxia-1α)86. Asimismo, se describió una reducción de los niveles de TNF-α por PBMT (950 nm; 2,5 J/cm2; 32 s; 15 días consecutivos; 37,5 J/cm2 de densidad de energía acumulada) en modelo de ratón con lesión por aplastamiento del nervio ciático87. Estos fragmentos de evidencia sugieren la capacidad antiinflamatoria de PBMT. En este sentido, los efectos antiinflamatorios promovidos por PBMT se observaron previamente en un modelo de inflamación inducida por carragenina, en el que se usaron láseres de bajo nivel de 660 nm y 684 nm (30 mW; 7,5 J/cm2; 196 s; un solo punto ) redujeron la formación de edema y la migración de células inflamatorias a las 4 h después de las inyecciones de carragenina88.
Las citocinas inflamatorias pueden activar diversos receptores de la membrana celular, transmitiendo así señales ambientales y, en varias líneas celulares, la activación de los receptores acoplados a proteína G (GPCR) y los receptores tirosina cinasas (RTK) activan las MAPK89. Las cascadas de señalización de MAPK son vías conservadas evolutivamente relacionadas con la transducción de señales intracelulares en respuesta a diversos estímulos extracelulares90. MAPK controla muchos procesos celulares, como el crecimiento, la proliferación, la diferenciación, la motilidad, la respuesta al estrés, la supervivencia y la apoptosis91. Los tres grupos de MAPK (p38; ERK1/2; JNK) pueden activarse mediante perturbaciones osmóticas derivadas de la glucosa, la ruta de los polioles, el estrés oxidativo y los productos finales de glicación avanzada (AGE)92. Estos eventos están muy involucrados en la etiología de DN1.
Para examinar una posible interacción entre la inflamación y la vía de MAPK, evaluamos más a fondo la expresión de proteínas y genes de MAPK en L4-L5 DRG, una vez que se supone que estos objetivos moleculares están alterados en DN, debido a una condición impuesta por la diabetes no controlada92. Antes de los experimentos de PCR cuantitativa en tiempo real, se probaron los cebadores para los genes diana (p38, ERK1/2 y JNK) y de mantenimiento (controles endógenos: Arfgef1 y Serpinb6) para determinar su eficacia mediante la construcción de curva estándar. Se realizó a través de diluciones seriadas de ADNc ingenuo (1:4; 1:8; 1:16; 1:32; 1:64) y una concentración de cebador fija (100 nM). Se observó una alta eficiencia para todos los cebadores probados, incluidos los controles endógenos (99,9; r2 0,98) (datos no mostrados). Luego, la expresión de los genes diana se normalizó mediante los valores medios de Ct (umbral del ciclo) de un grupo de expresión génica de Arfgef1 y Serpinb6.
En este estudio, observamos un aumento significativo en la expresión del ARNm de p38 en el grupo STZ en comparación con los grupos Naïve, SCB (vehículo) (p < 0,01) y SCB + PBMT (p < 0,001; prueba t de Student no apareada). Además, la expresión del ARNm de p38 en el grupo STZ fue significativamente mayor en comparación con el grupo STZ + PBMT (p < 0,05; prueba t de Student no apareada), como se muestra en la Fig. 4A. Una vez que PBMT no modifica la glucemia, concluimos que este efecto está asociado con hiperalgesia, evidente solo en el grupo STZ. No se observaron diferencias en el ARNm de p38 entre los grupos STZ + PBMT, SCB y Naïve. Las ligeras diferencias entre los grupos con respecto a la expresión de ARNm de ERK1/2 y JNK no fueron significativas (Fig. 4B, C).
Expresión cuantitativa de ARNm de MAPK. Los valores de expresión génica de p38 (A), ERK1/2 (B) y JNK (C) se normalizaron mediante un grupo de controles endógenos (Arfgef1 y Serpinb6) de expresión. PBMT disminuyó la expresión del ARNm de p38 en ratas hiperalgésicas (grupo STZ + PBMT). La hiperglucemia aumentó la expresión del ARNm de p38, pero no ERK1/2 y JNK en DRG asociados con hiperalgesia. Los datos se expresan como media ± SEM; símbolos (*), (**) y (***) significan p < 0.05, p < 0.01 y p < 0.001 (respectivamente) en las comparaciones entre STZ (símbolos rojos) y los otros grupos (Naïve, símbolos negros ; SCB, símbolos grises; SCB + PBMT, símbolos azules; STZ + PBMT, símbolos verdes); Prueba t de Student no apareada.
Los experimentos de inmunofluorescencia (IF) también encontraron un mayor aumento en la expresión de MAPK activada, especialmente p-p38, en el grupo STZ (Fig. 5H, I). La fluorescencia con respecto a la fosforilación de p-38 en ratas hiperalgésicas se redujo con la aplicación de PBMT en la región DRG, como se muestra en el grupo STZ + PBMT, en el que hubo una porción de activación de p-38 pero en un menor número de neuronas en comparación con el grupo STZ (Fig. 5K, L). Para los grupos STZ y STZ + PBMT, la activación de p38 estaba altamente concentrada en los núcleos de las neuronas aferentes de DRG, como lo muestra la tinción conjunta con DAPI (Fig. 5I, L en detalle). Además del menor número de neuronas p-p38 positivas en el grupo STZ + PBMT, también fue posible observar una mayor intensidad de fluorescencia dispersa en el citoplasma de las neuronas con algunas conformaciones similares a vesículas (Fig. 5K, L en detalle). Sin embargo, el significado de esta diferencia en comparación con las ratas no PBMT hiperalgésicas (grupo STZ) no está claro.
Micrografías histológicas DRG de p-p38 MAPK por microscopía confocal. Las secciones transversales de DRG de 14 µm de espesor se sometieron al protocolo IF para teñir la fosforilación de p38 endógena en Thr180 y Tyr182 (B,E,H,K). DAPI para tinción nuclear se muestra en (A, D, G, J). Las imágenes de combinación (DAPI + p-p38) también se muestran en (C,F,I,L). En (H) y (K), las flechas blancas apuntan a las áreas ampliadas. Los detalles se muestran en la esquina izquierda de (H,I,K,L). Ampliación: ×40; barras de escala: 50 µm.
De manera similar a los resultados de la expresión génica, se detectó una baja fosforilación de la proteína ERK1/2. Sin embargo, para los grupos SCB + PBMT y STZ + PBMT (Fig. 6E, K, respectivamente), los niveles de activación de p-ERK1/2 relacionada con la fluorescencia fueron aún más bajos en comparación con los grupos SCB y STZ (Fig. 6B, H , respectivamente). Una observación interesante con respecto al grupo STZ + PBMT es la presencia de p-ERK1/2 acumulado en la vecindad de la membrana plasmática, como se muestra en la Fig. 6K,L (en detalle).
Micrografías histológicas DRG de p-ERK1/2 MAPK por microscopía confocal. Secciones transversales DRG de 14 µm de espesor enviadas al protocolo IF para teñir la fosforilación de ERK1/2 en Thr202 y Tyr204 (p44/p42) (B,E,H,K). DAPI para tinción nuclear se muestra en (A, D, G, J). Las imágenes de fusión (DAPI + p-ERK1/2) también se muestran en (C,F,I,L). En (H) y (K), las flechas blancas apuntan a las áreas ampliadas. Los detalles se muestran en la esquina izquierda de (H,I,K,L). Ampliación: ×40; barras de escala: 50 µm.
De acuerdo con la fosforilación de ERK1/2, la aplicación de PBMT en la región DRG disminuye la expresión de p-JNK independientemente de la hiperalgesia (grupos SCB + PBMT y STZ + PBMT; Fig. 7E, K, respectivamente). Las ratas que no se sometieron a PBMT presentaron una expresión basal de p-JNK, observada de forma difusa en el citoplasma (grupos SCB y STZ; Fig. 7B,H, respectivamente).
Micrografías histológicas DRG de p-JNK MAPK por microscopía confocal. Las secciones transversales de DRG tenían un grosor de 14 µm y se sometieron al protocolo IF para la tinción de la fosforilación endógena de p-JNK en Thr183 y Tyr185 (p46/p54) (B,E,H,K). DAPI para tinción nuclear se muestra en (A, D, G, J). Las imágenes de combinación (DAPI + p-JNK) también se mostraron en (C, F, I, L). En (B) y (H), las flechas apuntan a una tinción difusa en el citoplasma. Ampliación: ×40; barras de escala: 50 µm.
Se ha demostrado que la activación de MAPK está asociada con alodinia e hiperalgesia en diferentes condiciones de enfermedad93,94,95. El miembro más estudiado de la familia MAPK, p38-MAPK, se activa típicamente por estrés extracelular y citocinas proinflamatorias, con un papel destacado en el proceso inflamatorio una vez que se produce una reducción significativa de la inflamación tras la administración sistémica del inhibidor farmacológico de p3896. Las ratas, entre 8 y 12 semanas después del tratamiento con STZ, mostraron activación de p38, JNK y ERK1/2 en L4-L5 DRG, aunque con activación retardada de JNK, en relación con p38 y ERK1/241. Se ha sugerido que el TNF-α y la IL-1β juegan un papel clave en el desarrollo y mantenimiento de los estados de dolor después de la lesión de los nervios periféricos97. Una vez que p38 regula la biosíntesis de TNF-α e IL-1β en GRD, ambas reducciones pueden culminar en efectos antiinflamatorios con reflejo positivo en analgesia97. Por lo tanto, nuestros datos mostraron que PBMT, un efector fotofísico y fotoquímico de eventos celulares, promueve una reducción de TNF-α e IL-1β asociada con una menor activación (fosforilación) de p38, lo que puede ayudar a explicar el efecto analgésico de la terapia.
Aunque nuestros datos demostraron una disminución, incluso leve, de la activación de MAPK por PBMT, la terapia con láser (He-Ne; 632,8 nm; 4,5 mW; 3 s cada 1,8 mm × 1,8 mm cuadrados) estudiada en cultivo de tejido de células de músculo esquelético demostró una aumento de ERK1/2, y ningún efecto sobre la expresión de p38 y JNK98. Además, la irradiación con láser (Er: YAG; 2,94 µm; fluencia entre 0,7 y 17,2 J/cm2) en cultivos de células de osteoblastos demostró la activación de ERK1/2 y ningún efecto sobre la expresión de p38 y JNK99. Entonces, el efecto de PBMT en la expresión de MAPK puede depender del tejido involucrado en esta terapia.
Se ha sugerido que la activación de p38 en el DRG se inicia mediante el transporte retrógrado de la liberación del factor de crecimiento nervioso (NGF) del tejido periférico, por ejemplo, cuando está inflamado. Aumenta la traducción y el transporte de TRPV1 (un canal receptor polimodal) a la terminal del nociceptor periférico, lo que contribuye al mantenimiento de la sensibilidad al dolor por calor. Además, p-p38 se encontró principalmente en neuronas pequeñas del GRD, lo que sugiere una mayor activación en las fibras sensoriales tipo C100.
Complementariamente a la tinción IF de p-p38 en DRG, se analizó adicionalmente si su expresión estaba involucrada en un tipo particular de fibras nerviosas, es decir, fibras tipo C (neuronas DRG pequeñas; amielínicas; TRPV1+). Se detectaron fibras TRPV1+ en secciones DRG de todos los grupos experimentales. Se clasificaron como tipo C, con mayor intensidad de fluorescencia y aparición en los grupos STZ y STZ + PBMT (Fig. 8K,O, respectivamente). La cotinción de fibras p-p38 y TRPV1+ se distribuyó ampliamente (Fig. 8L,P, respectivamente), con una prevalencia de la señal TRPV1+ (roja) sobre p-p38 (verde) en el grupo STZ + PBMT, como se muestra en Fig. 8P (en detalle).
Micrografías histológicas DRG de p-p38 MAPK y co-tinción de TRPV1 por microscopía confocal. Se realizaron secciones transversales de DRG en 14 µm de espesor y se sometieron al protocolo IF para teñir la fosforilación de p38 endógena en Thr180 y Tyr182 (B,F,J,N) y TRPV1 (C,G,K,O). DAPI para tinción nuclear se muestra en (A,E,I,M). Las imágenes de combinación (DAPI + p-p38 + TRPV1) también se muestran en (D, H, L, P). El grupo STZ + PBMT mostró una tinción moderada para p-p38 MAPK (N; flechas blancas) y una mayor tinción para TRPV1 (O; flechas blancas). Los detalles se muestran en la esquina izquierda de (L) y (P). Ampliación: ×40; barras de escala: 50 µm.
Existe una correlación entre TRPV1 y MAPK porque la entrada de Ca2+ a través de TRPV1 conduce a la liberación de ATP, la activación del receptor purinérgico P2Y2 y la transactivación del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se ha descrito que el aumento de [Ca2+]i y la unión de ATP a P2Y2 aumentan la IP3 intracelular a través de la fosfolipasa C (PLC). La regulación positiva de IP3 conduce a la apertura de canales operados por almacenamiento (SOC), lo que provoca la liberación de Ca2+ del retículo endoplásmico (RE). La transactivación anterior de EGFR mediada por TRPV1 provoca la señalización Ras/Raf/MAPK101.
El tejido cutáneo está inervado por terminaciones nerviosas nociceptivas TRPV1+102, se expone fácilmente a la luz solar y se activa con la luz ultravioleta (UV). La luz ultravioleta activa la entrada de Ca2+ y la corriente catiónica no selectiva en queratinocitos humanos inmortalizados (células HaCaT)103. Esta activación fue suprimida por la capsazepina, un antagonista de TRPV1, mostrando así una interacción entre los canales de luz y TRPV1103. En este sentido, Wang et al.104 demostraron que PBMT a través de un dispositivo láser de 980 nm (3 J/cm2; onda continua) inducía un efecto térmico y, en consecuencia, la activación de TRPV1 en células madre derivadas de tejido adiposo. Nuestros datos de DRG sugirieron que PBMT aumenta la expresión de TRPV1 en ratas hiperalgésicas diabéticas, aunque, como se describe a continuación, PBMT disminuyó la entrada de Ca2+ en el cultivo de neuronas DRG. Sin embargo, se deben realizar más estudios para investigar mejor la participación de TRPV1 en el efecto antihiperalgésico de PBMT aplicado en la región DRG de ratas hiperglucémicas.
La activación de la vía MAPK y su modulación por PBMT parece estar relacionada con la dinámica de Ca2+ en las neuronas DRG. El aumento de la intensidad de fluorescencia de las neuronas DRG teñidas con FLUO-4 AM se observó tras los estímulos con KCl 15 mM y, especialmente, KCl 50 mM para todos los grupos (Fig. 9A). Sorprendentemente, el aumento de la fluorescencia con respecto a Δ[Ca2+]i después de un estímulo con KCl 15 mM se observó principalmente en neuronas previamente mantenidas en el medio hiperglucémico (grupo con alto contenido de glucosa) (Fig. 9B,C). Por el contrario, las neuronas DRG mantenidas en un medio hiperglucémico (glucosa 55 mM) y expuestas a PBMT (grupo High-glucose + PBMT) mostraron una disminución significativa (p < 0,001) en la intensidad de la fluorescencia durante el estímulo con KCl 15 mM en comparación con el grupo High-glucose + PBMT. grupo glucosa (Fig. 9B,C). Durante el estímulo de KCl 50 mM, que se usó como control para el estímulo de la entrada de Ca2+ en las neuronas sensibles, se observó la principal diferencia (p < 0,05) entre la intensidad de fluorescencia del grupo con bajo contenido de glucosa en comparación con el grupo con bajo contenido de glucosa+. Grupo PBMT (Fig. 9D,E). Cuando cesó el estímulo de KCl 50 mM, la intensidad de la fluorescencia disminuyó en ambos grupos hiperglucémicos, aunque no volvió a los niveles basales (Fig. 9D,E).
PBMT disminuye la dinámica de calcio de las neuronas DRG aumentada por la hiperglucemia. La intensidad de la fluorescencia (ΔF = F − F0/F0) se analizó en neuronas DRG cultivadas en medios bajos (línea negra) o altos en glucosa (línea roja) durante 24 h y expuestas a PBMT (líneas verde y azul) justo antes de la prueba. . (A) Representación general de las intensidades de fluorescencia (ΔF = F − F0/F0) después de estímulos extracelulares con 5 mM (basal), 15 mM (intermedio) y 50 mM (alto) de KCl; ↑[K+]e se usó para generar un flujo de entrada de Ca2+ en las neuronas DRG incubadas con FLUO-4 AM. (B) Durante el estímulo intermedio (KCl 15 mM), hubo una diferencia significativa en el ΔF al comparar los grupos de alto contenido de glucosa y alto contenido de glucosa + PBMT (la comparación se realizó considerando el ΔF delimitado por las líneas de puntos horizontales); ANOVA de dos vías seguido de la prueba posthoc de Bonferroni. (C) Imágenes adquiridas a presión del cultivo de células DRG durante el lapso de tiempo, justo después del estímulo con KCl 15 mM. (D) En el estímulo alto (KCl 50 mM), hubo una diferencia significativa entre los grupos de glucosa baja y glucosa baja + PBMT. (E) Imágenes adquiridas a presión del cultivo de células DRG durante el lapso de tiempo, justo después del estímulo con KCl 50 mM. (F) Porcentaje (%) de células sensibles durante el estímulo de 15 mM; en el grupo con alto contenido de glucosa, alrededor del 60 % de todas las células sensibles, es decir, las células con mayor fluorescencia durante el estímulo con KCl 50 mM (control positivo), también respondieron al estímulo intermediario (KCl 15 mM), siendo estadísticamente diferentes de las demás. grupos Los datos se expresan como media ± SEM; los símbolos (*) y (***) significan p < 0,05 y p < 0,001, respectivamente, en comparación con el grupo de glucosa alta; ANOVA unidireccional seguido de la prueba posthoc de Bonferroni.
Más allá de la intensidad de fluorescencia (Δ[Ca2+]i), también cuantificamos el porcentaje (%) de células sensibles a KCl 15 mM sobre el número total de neuronas sensibles a KCl 50 mM (Fig. 9F). El % de neuronas que respondieron al estímulo de KCl 15 mM fue mayor en el grupo de glucosa alta en comparación con los grupos de glucosa baja (p < 0,001) y los grupos de glucosa alta + PBMT (p < 0,05). Estos datos sugieren que PBMT reduce la capacidad de respuesta de las neuronas DRG aumentada por la hiperglucemia. Por lo tanto, es plausible plantear la hipótesis de que uno de los posibles mecanismos analgésicos de PBMT en la región DRG es, al mismo tiempo, aumentar la expresión de TRPV1 en las neuronas DRG a través de p38 MAPK inducida por IL-1β y desensibilizar las neuronas TRPV1+ al disminuir el Ca2+. afluencia.
PBMT podría representar un enfoque terapéutico novedoso para el tratamiento de la hiperalgesia neuropática diabética, basado en sus efectos fotofísicos y fotoquímicos beneficiosos frente a las alteraciones funcionales, moleculares y celulares observadas en dicha enfermedad, regidas por la vía MAPK y la dinámica del calcio.
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Ética en el Uso Animal (CEUA/UNICAMP, permiso número 5337-1/2019) y siguieron las directrices ARRIVE. Los experimentos también se realizaron de acuerdo con las directrices del Consejo Nacional Brasileño para el Control de la Experimentación Animal (CONCEA) y el Colegio Brasileño de Experimentación Animal (COBEA). Se utilizaron ratas Lewis macho (LEW/HsdUnib, Harlan, EE. UU., 1996), de 4 a 8 semanas de edad, con un peso de 200 a 250 g, proporcionadas por el Centro Multidisciplinario de Investigaciones Biológicas (CEMIB) de la Universidad. Las ratas se mantuvieron en jaulas de plástico con ropa de cama de aserrín (cambiada tres veces por semana), en unas cuatro por jaula, y recibieron alimento (comida comercial para roedores) y agua filtrada ad libitum, en una habitación con temperatura y humedad controladas a menos de 12/ Ciclo de luz/oscuridad de 12 h.
Las ratas se dividieron aleatoriamente en cinco grupos experimentales, que constaban de ocho ratas (n = 8) por grupo: Naïve (ratas intactas; no recibieron inyección ni PBMT); SCB (recibió cinco dosis del vehículo, tampón de citrato de sodio 0,1 M y ninguna PBMT); STZ (recibió cinco dosis de STZ, 25 mg/kg por dosis y ninguna PBMT); SCB + PBMT (recibieron cinco dosis del vehículo y se sometieron a PBMT); STZ + PBMT (recibió cinco dosis de STZ y se sometió a PBMT). Se hicieron todos los esfuerzos para minimizar el número de ratas y su sufrimiento.
La inducción de DT1 se realizó según estudios previos realizados por nuestro grupo66,71,72,73,74, consistente en una dosis baja de STZ (25 mg/kg) (N-[Metilnitrosocarbamoil]-α-d-glucosamina; Sigma- Aldrich®, St. Louis, MO, EE. UU.]), diluido en el vehículo (tampón de citrato de sodio 0,1 M, SCB [pH 4,5]) e inyectado por vía intraperitoneal (ip) una vez al día, durante cinco días consecutivos (STZ y STZ + PBMT grupos). El mismo volumen de vehículo se inyectó diariamente en animales control (grupos SCB y SCB + PBMT), variando de 50 a 62,5 µL, según el peso de las ratas. Las mediciones de glucosa en sangre de la vena de la cola se realizaron con un Accu-Chek® Sensor Comfort (Roche Diagnostics®, Alemania). Se controló el desarrollo de hiperglucemia y el peso de las ratas los días 0, 7, 14, 21, 24 y 28 después de iniciar las inyecciones de STZ o vehículo.
La hiperalgesia fue medida a través de los umbrales de retiro mecánico, determinados por la aplicación del test electrónico de von Frey (Insight®, Ribeirão Preto, SP, Brasil). Utilizamos una punta de pipeta de polipropileno adaptada a un transductor de fuerza manual con presión creciente en la superficie plantar de las patas traseras derecha e izquierda de las ratas. El equipo convierte automáticamente la presión aplicada a la superficie plantar media de la pata en gramos-fuerza (g) una vez que se retira la pata. Las ratas se colocaron al azar en jaulas de plástico individuales con piso de malla metálica, seguidas de 30 minutos de aclimatación antes de la prueba. Se aplicaron pruebas electrónicas de von Frey a todos los grupos experimentales a los 0, 7, 14, 21, 24 y 28 días después de iniciar las inyecciones de STZ o vehículo, siempre a media mañana, por un examinador ciego a los grupos y tratamiento. Para el grupo STZ + PBMT, se realizó un análisis adicional 19 días después de comenzar las inyecciones de STZ para seleccionar solo ratas hiperalgésicas para la exposición a PBMT.
CatWalk Walking Track Test (Noldus Inc., Wageningen, Países Bajos) consiste en un piso de vidrio de pasarela iluminado con una cámara de video de alta velocidad (Gevicam GP-3360; GEViCAM Inc., Milpitas, CA, EE. UU.) Equipada con una lente gran angular (6,0 mm; DF6HA-1B, Fujinon Corp., China). La cámara se colocó debajo de la pasarela a 56 cm y el software CatWalk™ XT 10.6 registró automáticamente las huellas de las patas cuando el animal cruzó la pasarela en un carril calibrado de 20 × 10 cm de longitud. El LED verde más un fondo iluminado en rojo crea un contraste en el suelo de cristal según los pasos de los animales. Las configuraciones de CatWalk XT se establecieron de acuerdo con los parámetros utilizados por Vieira et al.74. Para el estudio actual, consideramos el promedio entre las patas traseras (pata trasera derecha [RH] y pata trasera izquierda [LH]) con respecto al Área máxima de contacto (cm2), Área de impresión (cm2) y Longitud de zancada (cm), que se analizaron a los 0, 7, 14, 21, 24 y 28 días después de iniciar STZ o inyecciones del vehículo, siempre por la tarde con las luces de la habitación apagadas. Cada rata realizó 3 carreras en cada período de análisis, completando así 24 carreras por grupo por período.
Las ratas de los grupos SCB + PBMT y STZ + PBMT se sometieron a PBMT durante ocho días (del día 21 al 28 después de las inyecciones de STZ o vehículo), una vez al día, siempre por la mañana. Para el grupo STZ + PBMT, solo las ratas hiperalgésicas se consideraron para recibir el tratamiento con láser ya que, en nuestro modelo DN, alrededor del 20 % de las ratas que recibieron inyecciones de STZ no se volvieron hiperalgésicas (datos no mostrados). La PBMT se realizó con un dispositivo láser Endophoton LLT1307 (KLD Biosistemas Equip. Elet. Ltda®, Amparo, SP, Brasil) clase IIIB. Las ratas se anestesiaron con isoflurano (3 %) (Cristália®, Itapira, SP, Brasil), y la irradiación láser se aplicó directamente sobre la piel afeitada del dorso de la rata en un único punto entre los niveles de la columna vertebral L4-L5, bilateralmente. Los parámetros de PBMT se describen en la Tabla 1.
Para los análisis de los niveles de citoquinas inflamatorias y la expresión del gen MAPK, las ratas fueron anestesiadas con isoflurano (3%) (Cristália®) y sacrificadas humanitariamente. Después de la disección, se recogieron L4 y L5 DRG, se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido (-196,15 °C) y se almacenaron a -80 °C para su posterior homogeneización. A las muestras de DRG para inmunoensayos ELISA, se les añadió RIPA Lysis and Extraction Buffer (Thermo Scientific™, Waltham, MA, EE. UU.), que contenía ortovanadato de sodio, inhibidor de proteasa y PMSF (fluoruro de fenilmetanosulfonilo) (Thermo Scientific™). Las muestras se colocaron en un homogeneizador FastPrep® (MP Biomedicals™, Santa Ana, CA, EE. UU.) y luego se agitaron a 4 °C (5 × 20 s) entre intervalos de 5 min. Después de eso, los GRD homogeneizados se mantuvieron bajo agitación continua durante 3 h a 4 °C y luego se centrifugaron a 12 000 rpm durante 15 min a 4 °C. El sobrenadante resultante se transfirió a un tubo nuevo. Las concentraciones de proteína se midieron mediante el ensayo de Bradford105.
Para la expresión del gen MAPK a través de RT-qPCR en tiempo real, los DRG se fragmentaron y homogeneizaron en TRIzol® (Invitrogen Life Technologies™, Carlsbad, CA, EE. UU.) (1 mL/mg) para aislar el ARN total, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Al homogeneizado se le agregaron 0.2 mL de cloroformo (Sigma-Aldrich®), y luego de 3 min de reposo a temperatura ambiente, se centrifugó a 12,000 rpm por 15 min a 4 °C. La fase acuosa se transfirió a un tubo nuevo, en el cual se agregaron 0.5 mL de isopropanol. Después de una nueva centrifugación, el sedimento se lavó con etanol al 75 % y el ARN total se resuspendió en agua tratada con UltraPure™ DEPC (Thermo Scientific™). El ARN DRG total se cuantificó utilizando un espectrofotómetro de volumen ultra bajo (Epoch Microplate Spectrometer, BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, EE. UU.).
Para la inmunofluorescencia (IF) de DRG, las ratas se anestesiaron con ketamina (85 mg/kg, ip) y xilazina (10 mg/kg, ip) y luego se desangraron mediante perfusión cardíaca (a través de la aorta ascendente) con solución salina (0,9% NaCl, 200ml). Después de la exanguinación, las ratas se perfundieron con paraformaldehído al 4 % (PFA, pH 7,4, 4 °C, 300 ml). Luego, L4 y L5 DRG se recolectaron y se fijaron posteriormente en PFA al 4 % durante la noche a 4 °C, seguido de 48 h en sacarosa al 30 % a 4 °C. Los DRG individuales se incluyeron en el compuesto Tissue-Tek® OCT (Sakura® Finetek, CA, EE. UU.) y se realizaron secciones no seriadas de 14 µm en un criostato (Leica Biosystems, Wetzlar, Alemania) utilizando portaobjetos gelatinizados.
Para IL-1β, TNF-α, IL-6 y CINC-1 se utilizaron placas de 96 pocillos a través del kit DuoSet® ELISA (R&D Systems, Minneapolis, MN, EE. UU.), y los resultados se expresaron en picogramos por mililitro (pg/mL). Para la IL-10, las concentraciones se midieron a través del kit RayBio® Rat IL-10 ELISA (#ELR-IL10) (RayBiotech, Peachtree Corners, GA, EE. UU.), y los resultados se expresaron en picogramos por mililitro por miligramo (pg/ ml/mg) de tejido. Se siguieron las instrucciones del fabricante para ambos kits ELISA. La absorbancia se determinó a 450 nm utilizando un lector de microplacas Asys UVM 340 (Biochrom Ltd., Cambridge, Reino Unido) y los resultados se obtuvieron comparando la densidad óptica con las densidades de la curva estándar.
500 ng de ARN total extraído de L4 y L5 DRG se sometieron a síntesis de ADNc (Kit de síntesis de ADNc SuperScript™ VILO™, Invitrogen Life Technologies™) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Se diseñaron cebadores específicos para los genes p38, ERK1/2, JNK, Arfgef1 y Serpinb6 con la herramienta "Pick Primers", disponible en NCBI/Primer-blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/ primer-blast) y sintetizado comercialmente. Los amplicones se establecieron en menos de 200 pares de bases, y los dímeros, los dímeros cruzados y las horquillas se eliminaron durante el diseño de los cebadores (o se mantuvieron al mínimo). Las secuencias de los cebadores se describen en la Tabla 2. La temperatura de hibridación se fijó en 60 °C y el contenido de GC (guanina-citosina) fue del 50 al 55 %.
El método 2−ΔΔCt106 realizó un análisis de expresión génica relativa a un índice de control interno. Las reacciones se llevaron a cabo en el StepOne Plus Real-Time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.) usando SYBR Green como señal fluorescente (Power SYBR™ Green PCR Master Mix, Applied Biosystems, EE. UU.) y 1:10 de cDNA obtenido de cada muestra.
Las secciones de DRG se incubaron en glicina 0,1 M durante 30 minutos, seguido de un bloqueo con albúmina de suero bovino (BSA) al 2 % y permeabilización en Triton X-100 al 0,2 % durante 1 hora a temperatura ambiente. Para anti-fosfo-p44/42 MAPK (ERK 1/2) y anti-fosfo-SAPK/JNK, se realizó un paso adicional antes del bloqueo de BSA al 2%, consistente en permeabilización con metanol al 100% a -20 °C. Luego, las secciones se incubaron en PBS 0,1 M más Triton-100 al 0,1 % y BSA al 1 % durante la noche en una atmósfera húmeda a 4 °C con los anticuerpos primarios específicos. Se usaron los siguientes anticuerpos: anti-fosfo-p38 MAPK (Thr180/Tyr182) (D3F9) XP® Rabbit mAb (1:500); anti-fosfo-p44/42 MAPK (ERK 1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP® Rabbit mAb (1:200); y anti-fosfo-SAPK/JNK (Th183/Tyr185) (G9) Mouse mAb (1:400), todos de Cell Signaling Technology® (Danvers, MA, EE. UU.). Después del período de incubación, las secciones se lavaron dos veces en la misma solución de incubación (sin los anticuerpos) y luego se lavaron 5 veces en PBS 0,1 M, 5 min cada vez. A continuación, las secciones se incubaron con los anticuerpos secundarios (burro anti-conejo o anti-ratón Alexa 488, 1:1000, n.º A21206, Thermo Scientific™) diluidos en la misma solución de anticuerpo primario durante 1 h a temperatura ambiente. Después de la incubación, las secciones de DRG se lavaron con PBS 0,1 M cinco veces durante 5 min.
Los núcleos se tiñeron con diclorhidrato de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, 0,25 µg/mL, D9542, Sigma-Aldrich®) diluido en PBS 0,1 M, durante 10 min a temperatura ambiente y las secciones se cubrieron con cubreobjetos usando Vectashield® ( Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.). Los controles negativos se prepararon sin incubación en anticuerpos primarios para confirmar la unión no específica. Los portaobjetos se examinaron primero en un microscopio Leica DMi6000 B invertido de epifluorescencia acoplado con una cámara DFC360 FX y una fuente de luz fluorescente Leica CTR7000HS (Leica Microsystems). Después de la confirmación de la fluorescencia positiva, las imágenes finales se obtuvieron en un microscopio confocal de barrido láser Zeiss Axio Observer Z1 LSM780-NLO (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania), con la ayuda del EC Plan-Neofluar 20x/0.50 Dry and Lente de objetivo EC Plan-Neofluar 40×/1.30 Oil DIC.
El cultivo celular primario de neuronas de GRD se realizó según el protocolo descrito por Linhart et al.107 y modificado por nuestro grupo de investigación según lo publicado por Manzo et al.108 y do Prado et al.73. Se utilizaron ratas Lewis macho sanas (LEW/HsdUnib, Harlan, EE. UU., 1996) con un peso aproximado de 200 g, de 4 semanas de edad. Las ratas fueron sacrificadas humanitariamente bajo anestesia profunda (3% de isoflurano; Cristália®) seguido de decapitación. Se recogieron de dieciséis a veinte GRD torácicos y lumbares y se colocaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, que contenía 10 mM de HEPES). Luego, las células se disociaron mediante incubación con HBSS que contenía 0,28 U/mL de colagenasa tipo II durante 60 min a 37 °C seguido de 6 min en 0,25 mg/mL de tripsina. Para la inhibición de la acción de la tripsina, las células se lavaron dos veces en DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS; 10 %), 50 U/mL de penicilina y 50 mg/mL de estreptomicina. Las células disociadas mecánicamente se colocaron en placas sobre cubreobjetos recubiertos con laminina y poli-d-lisina y se mantuvieron a 37 °C y 5 % de CO2. Todos los suministros de cultivo celular se adquirieron de Sigma-Aldrich® excepto FBS, adquirido de Vitrocell Embriolife (Campinas, SP, Brasil).
Después de completar la incubación de 24 h en medio celular normoglucémico (5,5 mM de glucosa) o hiperglucémico (55 mM de glucosa), las neuronas sensoriales DRG se expusieron a PBMT con los mismos parámetros descritos en la Tabla 1 pero con contacto indirecto a través del "movimiento de deslizamiento". , donde la salida de la sonda láser se mantuvo a una distancia de 1 cm del medio celular. Inmediatamente después de la irradiación, las neuronas cultivadas con DRG se incubaron en HBSS que contenía 10 µM de FLUO-4, AM y 1 % de PowerLoad (Thermo Scientific™) durante 40 min, protegidas de la luz a 37 °C y 5 % de CO2. Los cubreobjetos se insertaron en una cámara de perfusión (Warner Instruments, Holliston, MA, EE. UU.) y se colocaron en un microscopio invertido Leica DMi6000 B acoplado a una cámara DFC360 FX y una fuente de luz fluorescente Leica CTR 7000 HS (excitación de 480 nm, 527/30 nm filtros de supresión) (Leica Microsystems). Se utilizó un sistema de válvulas controlado por computadora (Warner Instruments) para la perfusión celular con diferentes molaridades de KCl [5 mM (basal), 15 mM (parcial) y 50 mM (máximo)], y la velocidad de flujo se fijó en 5 mL/ min (cambio completo del volumen de la cámara cada 2 s)73,108. Las imágenes se tomaron a razón de una imagen/s, y los valores de intensidad de fluorescencia (Δ[Ca2+]i) se normalizaron por ΔF/F0, donde ΔF es igual a la fluorescencia final (F) menos la fluorescencia basal (F0). Los datos también se presentaron como el % de células sensibles a KCl 15 mM sobre el número total de células sensibles a KCl 50 mM, en cuatro situaciones distintas: (i) cuando las células se incubaron con poca glucosa; (ii) glucosa baja más PBMT; (iii) alto contenido de glucosa o (iv) alto contenido de glucosa más PBMT.
Para las comparaciones entre los grupos y el tiempo de tratamiento, utilizamos ANOVA de dos vías seguido de la prueba posthoc de Bonferroni. El ANOVA unidireccional hizo otras comparaciones entre tres o más grupos, seguido de la prueba posthoc de Bonferroni. Para las comparaciones entre solo dos grupos, utilizamos una prueba t de Student no pareada. p < 0,05 (*), p < 0,01 (**) y p < 0,001 (***) se consideraron estadísticamente significativos. Todas las pruebas estadísticas se realizaron en el software GraphPad Prism®, versiones 5 y 7. Los valores numéricos se expresaron como media ± error estándar de la media (SEM).
Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles previa solicitud al autor correspondiente [CAP].
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Este estudio fue financiado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP) (Becas 2014/25153-7; 2015/12673-5; 2018/05108-8) y por la Coordinación de Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES). Deseamos agradecer al Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Fotónica Aplicada a la Biología Celular (INFABiC; Campinas, Brasil) por el apoyo en la adquisición de imágenes; también agradecemos a César Eduardo Bissoto por todo el soporte técnico.
Departamento de Biología Estructural y Funcional, Instituto de Biología, Universidad de Campinas (UNICAMP), Carl von Linnaeus s/n, Cidade Universitária Zeferino Vaz, Campinas, SP, 13083-864, Brasil
Willians Fernando Vieira, Kauê Franco Malange, Silviane Fernandes de Magalhães, Júlia Borges Paes Lemes, Gilson Gonçalves dos Santos, Catarine Massucato Nishijima, Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Maria Alice da Cruz-Höfling, Cláudia Herrera Tambeli & Carlos Amilcar Parada
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WFV y CAP diseñaron el estudio; WFV, KFM, SFM, JBPL, GGS y CMN llevaron a cabo los experimentos; WFV, ALRO, MACH, CHT y CAP redactaron el manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente el manuscrito y lo aprobaron para su envío.
Correspondencia a Carlos Amilcar Parada.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
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Vieira, WF, Malange, KF, de Magalhães, SF et al. Los efectos antihiperalgésicos de la terapia de fotobiomodulación (904 nm) en la neuropatía diabética inducida por estreptozotocina implican la vía MAPK y la modulación de la dinámica del calcio. Informe científico 12, 16730 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19947-2
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Recibido: 30 Abril 2022
Aceptado: 06 septiembre 2022
Publicado: 06 octubre 2022
DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19947-2
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