Tomografía optoacústica multiplexada de longitud de onda de frecuencia

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4448 (2022) Citar este artículo

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La optoacústica (OA) se implementa abrumadoramente en el dominio del tiempo (TD) para lograr altas relaciones señal-ruido al maximizar el transitorio de energía de la luz de excitación. Se han propuesto implementaciones en el dominio de la frecuencia (FD), pero sufren de bajas relaciones señal/ruido y no han ofrecido ventajas competitivas sobre los métodos del dominio del tiempo para alcanzar una alta difusión. Por lo tanto, comúnmente se cree que TD es la forma óptima de realizar optoacústica. Aquí presentamos un concepto optoacústico basado en la iluminación del tren de pulsos y la multiplexación en el dominio de la frecuencia y demostramos teóricamente los méritos superiores del enfoque en comparación con el dominio del tiempo. Luego, utilizando los avances recientes en la iluminación de diodos láser, lanzamos la tomografía optoacústica de multiplexación de longitud de onda de frecuencia (FWMOT), en múltiples longitudes de onda, y mostramos experimentalmente cómo FWMOT optimiza las relaciones señal-ruido de las mediciones espectrales sobre métodos de dominio de tiempo en fantasmas y en Vivo. Además, encontramos que FWMOT ofrece la operación multiespectral más rápida jamás demostrada en optoacústica.

La generación de señales optoacústicas (OA) requiere la iluminación de la muestra con transitorios de energía (p. ej., iluminación pulsada o sinusoidal)1. La muestra absorbe esta energía variable en el tiempo y, posteriormente, genera una onda acústica a través de la expansión termoelástica2. Las implementaciones de OA en el dominio del tiempo (TD) ofrecen grandes transitorios de energía por medio de pulsos de luz de duración de nanosegundos3,4,5,6, para satisfacer los límites de confinamiento térmico y de tensión necesarios para la generación de señales optoacústicas7. Un pulso de duración de nanosegundos también maximiza el transitorio de energía y optimiza la relación señal-ruido (SNR), lo que convierte a TD en el dominio de elección en optoacústica8,9,10. Las imágenes optoacústicas TD registran el tiempo de vuelo de las ondas ultrasónicas (US) generadas en múltiples ubicaciones en la superficie del objeto interrogado por medio de un transductor ultrasónico sensible y, mediante inversión matemática, convierte estas mediciones en mapas tridimensionales de absorción óptica11.

Otras modalidades de imagen, como la tomografía de coherencia óptica (OCT) o la imagen por resonancia magnética (MRI), se demostraron originalmente en el TD, pero se han beneficiado, en términos de velocidad de imagen y SNR, al cambiar la operación al dominio de frecuencia (FD)12,13 . La optoacústica de dominio de frecuencia (FD) también se ha considerado como una alternativa a la TD, al modular la intensidad de la iluminación a una frecuencia discreta y detectar las señales OA generadas a la misma frecuencia14,15,16. La detección de señales se logra con técnicas de demodulación que recuperan la amplitud y la fase de la señal OA, una tecnología que es más simple y económica que registrar señales de tiempo a tasas de muestreo de decenas de MHz, como es común en la detección de TD. FD también puede permitir la iluminación simultánea en múltiples longitudes de onda, mediante la modulación de fuentes de diferentes colores en diferentes frecuencias17,18,19. A pesar de estas ventajas, la luz de intensidad modulada14,15,16 proporciona transitorios de energía y las correspondientes señales optoacústicas que son tan bajas como seis órdenes de magnitud19 más débiles que los pulsos ultracortos utilizados en TD, lo que reduce drásticamente la SNR en el FD20,21,22. Además, las investigaciones optoacústicas en una sola frecuencia no logran recopilar información de profundidad ni generar imágenes tridimensionales. Recientemente hemos demostrado23 que la información de profundidad y la reconstrucción de imágenes tridimensionales requieren la generación de señales en múltiples frecuencias discretas, un requisito que conduce a esquemas complejos de emisión (modulación) y detección (demodulación)23,24. Por lo tanto, a pesar de las ventajas potenciales sobre TD17,18,19,23,24, FD ha tenido poco impacto en el campo de la optoacústica. El chirp de frecuencia también se ha investigado como un método híbrido TD-FD, mediante la modulación de la luz a una frecuencia que varía continuamente17,25, codificando así el tiempo en frecuencia. La detección se realiza en el TD mediante técnicas de correlación temporal. Sin embargo, de manera similar a los métodos FD, el uso de ondas sinusoidales limita la SNR lograda, restringiendo el uso de enfoques chirp para investigaciones experimentales.

Aquí, proponemos la operación de frecuencia de longitud de onda multiplexada (FWM) para mejorar categóricamente el rendimiento de TD, al tiempo que minimiza las desventajas de FD. FWM es efectivamente la implementación inversa de la optoacústica chirp, utilizando un tren de pulsos discretos, similar a los empleados en la optoacústica TD, pero procesando las frecuencias discretas resultantes que aparecen en el FD23, una respuesta que es análoga a la apariencia de peine de frecuencia que se ve en frecuencias espectrales. Como se muestra aquí, la iluminación FWM también permite la iluminación simultánea en múltiples longitudes de onda sin aumentar el tiempo de formación de imágenes y sin producir una ganancia de SNR que aumenta por la raíz cuadrada del número de longitudes de onda N empleadas, sobre los sistemas TD. Siguiendo consideraciones teóricas, planteamos la hipótesis de que los diodos láser sobrecargados26, que ofrecen una alternativa más económica y práctica a los láseres de estado sólido, podrían explotar los trenes de pulsos FWM y generar imágenes optoacústicas de alta calidad que podrían demostrar beneficios sobre las implementaciones TD. Presentamos un sistema de tomografía optoacústica multiplexada de longitud de onda de frecuencia (FWMOT) que utiliza 4 diodos láser saturados de pulsación simultánea, cada uno de los cuales utiliza una tasa de repetición ligeramente diferente para codificar diferentes longitudes de onda. Estas longitudes de onda aparecen entonces en diferentes frecuencias discretas en el dominio de la frecuencia. Mostramos imágenes mesoscópicas27 de múltiples longitudes de onda concurrentes de la dinámica linfática y microvascular en ratones con altas SNR, que ofrecen la iluminación de múltiples longitudes de onda más rápida jamás lograda en el campo de la optoacústica y confirman el rendimiento espectral que mejora las implementaciones de TD.

En la operación TD convencional, un pulso de luz cuadrado de duración tp (Fig. 1a) produce un espectro de frecuencia continuo en el FD, a través de la Transformada de Fourier, con el primer nodo en la frecuencia 1/tp. En la operación FD, la luz modulada por una onda sinusoidal en el TD (Fig. 1b) produce una sola frecuencia discreta en el FD. En cambio, la modulación multiplexada por longitud de onda de frecuencia considera un tren de pulsos (Fig. 1c) con un ancho de pulso de tp y una tasa de repetición frep. La Transformada de Fourier de este tren de pulsos produce muchas frecuencias discretas con una envolvente (Fig. 1c, derecha) idéntica al espectro continuo de un solo pulso con duración tp (Fig. 1a, derecha). Las frecuencias discretas del tren de pulsos son armónicos de la tasa de repetición fundamental, frep, es decir, múltiplos enteros de frep. Una mayor tasa de repetición aumenta el número de pulsos en el TD y reduce los picos discretos en FD (Fig. 1d). En el FD, un ancho de pulso más largo hace que el primer nodo (en 1/tp) aparezca en frecuencias más bajas (Fig. 1e), reduce la densidad de energía general en frecuencias más altas y reduce la resolución espacial28.

a Un solo pulso de luz de excitación de duración tp en TD (izquierda) y un espectro continuo de frecuencias en FD (derecha). b Una onda sinusoidal de frecuencia f en TD y FD, onda continua en TD y un único pico discreto en FD. c Un tren de pulsos con duración de pulso tp y tasa de repetición frep en TD y FD. Muchos pulsos discretos en TD y muchas frecuencias discretas en FD con la misma envolvente que un solo pulso de duración tp en a. d Un tren de pulsos con duración de pulso tp y tasa de repetición 2frep en TD y FD. El doble de pulsos en TD pero la mitad de frecuencias discretas en FD en comparación con c. e Un tren de pulsos con duración de pulso 2tp y tasa de repetición 2frep en TD y FD. Tantos pulsos en TD y frecuencias discretas en FD como en d pero ahora siguiendo una envolvente diferente a (a) o (c). f La señal optoacústica sin procesar registrada utilizando un tren de pulsos como (c), por ejemplo, con 1, 2, 3 y... indicando los diferentes períodos. g, h presentan el promedio normal en TD. g El tren de pulsos se divide en tramos de periodo T = 1/frep, indicados por 1, 2, 3 y… que se promedian (h) punto por punto. i, j El procesamiento multiplexado de longitud de onda de frecuencia de la misma señal. i La transformada de Fourier de la señal optoacústica sin procesar (f) con muchas frecuencias discretas que son todas armónicas (k * frep con k entero positivo) de la tasa de repetición base frep. En FD elegimos solo los armónicos de frep y descartamos todas las demás frecuencias que contienen solo ruido (j). k Realizando la Transformada de Fourier inversa en j recuperamos la señal TD que coincide perfectamente con la de h.

La validación experimental del esquema FWM se realizó excitando una capa de barniz negro en una placa de Petri usando solo L1 (Fig. 1f, g). Promediar en TD (Fig. 1g, h) aumenta la SNR por un factor de \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p}}}}}}}}\), donde Np es el número de pulsos en el tren de pulsos. Por el contrario, el método FWM propuesto selecciona la frecuencia fundamental frep y sus armónicos, k * frep, siendo k un número entero (Fig. 1i) realizando la siguiente operación (ver la Nota complementaria 1):

donde Sa (ω) es la Transformada de Fourier de la señal promediada, Sr (ω) la Transformada de Fourier de la señal registrada (Fig. 1f), Nh el número de armónicos en el ancho de banda del transductor de ultrasonido detectado y ω0 = 2π/T. La señal OA se genera exactamente a las mismas frecuencias que contiene el tren de pulsos LD de excitación. Por lo tanto, la operación (1) selecciona solo los armónicos de frep y filtra las frecuencias que no contienen señal para aumentar la SNR por el mismo factor \(\scriptstyle{\sqrt{{N}_{{{{{\rm{p }}}}}}}}\) como en el TD (Fig. 1j). La señal en la Fig. 1j es la Transformada de Fourier de la señal en la Fig. 1h, con las dos señales que coinciden perfectamente (Fig. 1k). Este análisis confirma que la iluminación FWM da como resultado una generación práctica de múltiples frecuencias discretas, requeridas para una operación FD precisa, que ofrece una SNR que es equivalente a la TD cuando se usa una sola longitud de onda. El análisis FWM es, por lo tanto, el espacio de Fourier equivalente al promedio de tiempo normal. A continuación, mostramos, sin embargo, que FWM ofrece ventajas sobre TD cuando se emplean múltiples longitudes de onda.

Para demostrar la ventaja de FWM sobre el TD (Fig. 2), trazamos el patrón de excitación de longitud de onda única en el TD y su espectro de potencia en el espacio de Fourier (Fig. 2a) para que sirva como referencia para el análisis que sigue. El tren de pulsos que se muestra tiene un período T que corresponde a una tasa de repetición frep = 1/T, un número total de pulsos Np, un ancho de pulso tp y un tiempo de adquisición tacq = Np × T. El período T define la profundidad máxima de -ver DoV = vs × T que se puede lograr para el tren de pulsos seleccionado, donde vs es la velocidad del sonido.

a Un tren de pulsos de una longitud de onda con periodo T y tasa de repetición frep = 1/T, con Np pulsos y tiempo de adquisición tacq en el dominio del tiempo (TD, izquierda) y dominio de Fourier (derecha), con k frep los armónicos de frep con k un entero b–d Excitación de múltiples longitudes de onda en TD Optoacoustic (OA). b El patrón de excitación de 4 longitudes de onda emitiendo a la misma tasa de repetición frep con un cambio de tiempo T/4, pulsos Np para todas las longitudes de onda y tiempo de adquisición tacq. c El patrón de excitación de 4 longitudes de onda con tasa de repetición frep/4, pulsos Np/4 para cada longitud de onda y tiempo de adquisición tacq. d El patrón de excitación de cuatro longitudes de onda con tasa de repetición frep/4, pulsos Np por longitud de onda pero con tiempo de adquisición 4tacq. e Excitación FWMOT donde las cuatro longitudes de onda tienen diferentes tasas de repetición frep,1, frep,2, frep,3, frep,4, Np pulsos para cada longitud de onda y tiempo de adquisición tacq. f–j La señal OA registrada por una capa de barniz negro en una placa de Petri de los patrones de excitación en (a–e) respectivamente. La relación señal-ruido (SNR) y el nivel de ruido se insertan para todos los casos. f α, la interferencia electromagnética del circuito del diodo láser cuando se activa, β la señal OA del barniz negro, γ el reflejo de la señal OA en la placa de Petri o en la lente acústica del transductor de ultrasonido. g La señal OA del patrón de excitación b para todas las longitudes de onda (línea superior) es la suma de la señal OA de cada longitud de onda (línea inferior), con una profundidad de visión (DoV) drásticamente reducida para cada longitud de onda. Se indican la interferencia del láser, la señal OA y sus reflejos (α, β, γ) para cada longitud de onda. h La señal OA en cada longitud de onda tiene una SNR reducida. i La señal OA tiene la misma SNR pero con mayor tiempo de adquisición. j La señal de las cuatro longitudes de onda se recuperó sin interferencias entre los láseres y se registró correctamente a tiempo sin comprometer la DoV, la SNR o el tiempo de adquisición. Azul, rojo, naranja, morado y verde se utilizan para indicar el láser 1, el láser 2, el láser 3 y el láser 4, respectivamente.

La multiplexación de longitud de onda TD se realiza mediante entrelazado de longitud de onda o tiempo compartido. Sin embargo, al aumentar el número de longitudes de onda en el TD, al menos uno de los siguientes tres parámetros debe verse comprometido: el DoV, el número de pulsos en el tren de pulsos y, por lo tanto, la SNR para cada longitud de onda, o el tiempo total de adquisición. La Figura 2b muestra cómo se reduce el DoV cuando se utilizan cuatro longitudes de onda en un tiempo de adquisición total dado. Las diferentes longitudes de onda excitan el tejido usando la misma tasa de repetición frep pero con un cambio de tiempo tsh entre cada longitud de onda (Fig. 2a), dado por tsh = T/N, donde N es el número de longitudes de onda. El resultado es una reducción del tiempo entre pulsos subsiguientes, limitando el DoV disponible para cada longitud de onda por un factor N. Alternativamente, es posible retener el DoV original bajando la tasa de repetición para cada longitud de onda, j, a frep,j = frep/N y el número de pulsos por longitud de onda a Np/N (Fig. 2c); sin embargo, este enfoque da como resultado una reducción de SNR por un factor de \(\sqrt{N}.\) Una tercera alternativa conserva el DoV y SNR originales mientras prolonga el tiempo de adquisición por un factor N (Fig. 2d).

A diferencia de TD, FWMOT emplea un pequeño cambio de frecuencia δf para la tasa de repetición de cada longitud de onda (Fig. 2e; tiempo), por lo que δf << frep. Cada longitud de onda tiene una tasa de repetición diferente, lo que da como resultado un DoV efectivo ligeramente diferente; sin embargo, dado que δf << frep, esta diferencia es insignificante. El espectro de potencia del patrón de excitación FWMOT (Fig. 2e; derecha) muestra la aparición de armónicos de la tasa de repetición fundamental para cada longitud de onda. La tasa de repetición del primer láser, frep,1, se puede seleccionar como la tasa de repetición de referencia, con la tasa de repetición de los láseres restantes dada por frep,j = frep,1 + (j − 1) * δf. FWMOT recupera así las señales OA evaluando la ecuación. (1) con el correspondiente ω0 = 2πfrep,j para cada longitud de onda. En consecuencia, al usar la separación de frecuencias, FWMOT puede multiplexar diferentes longitudes de onda sin comprometer el DoV, SNR o el tiempo de adquisición. Con la señal procesada en el FD, la resolución de frecuencia se define por df = 1/tacq, donde tacq = Np/frep,1, lo que significa que las frecuencias que difieren en menos de df no se pueden resolver. Para recuperar la señal OA de todas las longitudes de onda, todos los armónicos de todos los láseres que se encuentran en el ancho de banda de detección del transductor de ultrasonido (UST) deben por lo tanto espaciarse a una distancia que exceda la resolución de frecuencia df, imponiendo un número mínimo de pulsos Np,min que depende de los límites de ancho de banda de UST (flujo y fhigh), N y frep,1 (consulte la Nota complementaria 2). Los parámetros N, flow, fhigh, frep,1 y el número de pulsos elegido, Np, definen el rango de pequeños desplazamientos de frecuencia (δf), entre δfmin y δfmax, necesarios para recuperar la señal de cada longitud de onda sin pérdidas. Un valor de δf mayor que δfmin asegura que los armónicos del láser j y j + 1, que se encuentran en el extremo inferior del ancho de banda de UST, estén bien resueltos, mientras que un valor de δf menor que δfmax asegura que los armónicos del láser 1 y N, que se encuentran en el extremo superior del ancho de banda de UST, están bien resueltos.

Para demostrar experimentalmente las ventajas de la operación FWM en la excitación de múltiples longitudes de onda en comparación con la optoacústica TD, empleamos FWMOT con las cuatro longitudes de onda. La señal optoacústica resultante en la longitud de onda 1, frep,1 = 200 kHz y Np = 200 se presenta en la Fig. 2f y alcanzó tacq = 1 ms y DoV = 7,5 mm. La interferencia electromagnética del circuito de activación del diodo láser (LD) se indica con α. La señal OA primaria generada a partir de barniz negro en una placa de Petri se indica con β, mientras que los reflejos de la lente de vidrio UST que llegan más tarde se indican con γ. El recuadro "Nivel de ruido" muestra una medición separada del nivel de ruido que produjo una desviación estándar de 90,6 μV. Se midió que la intensidad de la señal OA de LD1 era de 12 mV, lo que resultó en una SNR de 21,2 dB.

La Figura 2g presenta la señal OA promediada en el TD, cuando la DoV está comprometida. Cada LD tiene frep,j = 200 KHz, Np = 200 y un cambio de tiempo entre ellos que da como resultado DoV = 1,875 mm y tacq = 1 ms. La señal OA resultante de la excitación simultánea utilizando el patrón de la Fig. 2b se presenta como una línea verde y es la suma de las señales OA individuales obtenidas cuando cada longitud de onda se pulsó por separado (Fig. 2g). Podríamos detectar fácilmente la interferencia del disparador láser para todas las longitudes de onda (α). Las señales OA de las longitudes de onda 1 y 2 (β) se ubican muy cerca de la interferencia del láser (α) de las longitudes de onda 3 y 4 respectivamente, lo que reduce enormemente su SNR (5,7 dB para la longitud de onda 1). Sin embargo, la señal OA de la longitud de onda 3 está completamente enmascarada por la interferencia de la longitud de onda 1. Los reflejos de la señal OA de la longitud de onda 1, 2 y 3 (γ) todavía son visibles. Por lo tanto, la interferencia electromagnética y los reflejos de OA limitan aún más el DoV y SNR logrados en la optoacústica TD de múltiples longitudes de onda.

Asimismo, se imponen límites de SNR (Fig. 2h) en respuesta a un patrón de excitación (Fig. 2c) que utiliza frep,j = 50 kHz, Np = 50 y DoV = 7,5 mm para cada longitud de onda con tacq = 1 ms. Para todas las longitudes de onda, observamos que la interferencia del láser (α), la señal OA (β) y los reflejos (γ) son todos visibles pero con una SNR más baja. En este caso, la desviación estándar del ruido (presentada en los recuadros de la Figura) fue de 161,6 μV, que es superior a los 90,6 μV medidos en el tren de pulsos con 200 pulsos en promedio (Fig. 2f), mientras que la intensidad de la señal se mantuvo en 12 mV, lo que resultó en una SNR de 18,8 dB para la longitud de onda 1. Finalmente, con frep,j = 50 kHz, Np = 200 y DoV = 7,5 mm para cada láser, la señal OA de los 4 láseres se puede registrar sin pérdidas de SNR (N = 90,6 μV y S = 12 mV con 21,2 dB para la longitud de onda 1) pero con un tiempo de adquisición mayor, tacq = 4ms, que se presenta en la Fig. 2i.

Por el contrario, la operación FWMOT para cuatro longitudes de onda usa frep, 1 = 200 kHz, δf = 125 Hz y Np = 200 y recupera cada señal sin interferencia entre longitudes de onda (Fig. 2j), confirmando experimentalmente las predicciones teóricas. Figs suplementarias. 4 y 5 presentan la serie temporal de excitación del diodo láser, la serie temporal de la señal OA correspondiente y los espectros de potencia de ambos, para mostrar aún más el funcionamiento de FWMOT y verificar la capacidad del método para recuperar cada señal sin diafonía (consulte la Nota complementaria 3) . FWMOT puede proporcionar una alta SNR para excitación concurrente con múltiples longitudes de onda, sin extender el tiempo de adquisición (1 ms) y logrando el mismo DoV (7,5 mm) y SNR (aquí nuevamente N = 90,6 μV y S = 12 mV, lo que resulta en un SNR de 21,2 dB para longitud de onda 1).

Esperaríamos un aumento de SNR de 3 dB al aumentar el número de mediciones promediadas de 50 a 200. Sin embargo, medimos un aumento de SNR de 2,3 dB tanto para el promedio de TD como para FWM. Esta discrepancia se puede atribuir a la presencia de ruido electromagnético sistemático en el sistema, que también se promedia y reduce la SNR en 0,7 dB. Sin embargo, este efecto es una característica general del sistema OA y no una desventaja del algoritmo FWM.

También comparamos la SNR obtenida en la optoacústica FD convencional con FWMOT mediante el empleo del mismo fantasma de barniz negro y la iluminación de longitud de onda única a 445 nm (consulte la Fig. 1 complementaria). La optoacústica FD empleó una onda sinusoidal de 20 MHz de frecuencia con potencia media ajustada para igualar la salida de potencia media del patrón pulsado FWMOT utilizado para pulsos de 6,8 ns a 200 KHz. FWMOT demostró una SNR que fue 20,8 dB más alta en comparación con la excitación FD.

Si bien los méritos teóricos de la operación optoacústica FWM se demostraron con mediciones fantasma, el siguiente paso crítico fue examinar si FWM podría ofrecer implementaciones realistas. Por esta razón, nuestro objetivo fue investigar si las ventajas teóricas podrían conducir a características operativas (SNR, velocidad de adquisición) que harían que FWMOT fuera apropiado para aplicaciones in vivo. Un parámetro desconocido particular en esta interrogación fue el rendimiento de FWMOT logrado con múltiples longitudes de onda usando diodos láser, ya que no sería práctico implementar FWMOT con múltiples láseres de estado sólido debido al costo y tamaño. Para examinar los méritos del uso de tecnología de bajo costo, investigamos el rendimiento de múltiples diodos láser para obtener imágenes de la vasculatura y los vasos linfáticos in vivo, utilizando la oreja del ratón como modelo. Este objetivo de imagen se seleccionó porque es un tejido típico en el que se han demostrado convencionalmente las implementaciones optoacústicas de TD.

Primero, evaluamos si FWMOT podría producir imágenes de alta calidad a partir de muestras biológicas. Empleamos iluminación FWM a 445 nm y 465 nm y resolvimos la oxi y desoxihemoglobina (Fig. 3a, b) en función de su diferencia espectral, con la hemoglobina desoxigenada absorbiendo más a 445 nm y viceversa. Los datos se recopilaron en una cuadrícula y primero se promediaron punto por punto utilizando el algoritmo FWM antes de introducirlos en el algoritmo de reconstrucción (ver métodos). La superposición de las Fig. 3a, b reveló una imagen compuesta codificada por colores (Fig. 3c) de la oxigenación vascular relativa, con el color rojo correspondiente a los niveles de oxigenación más altos. Además, confirmamos que FWMOT puede producir imágenes resueltas en profundidad (consulte la Fig. 2 complementaria) sin interferencias entre las longitudes de onda, lo que ofrece la primera evidencia de que FWMOT puede adquirir imágenes de tejidos biológicos basados en LD.

a y b Una oreja de ratón en las dos longitudes de onda azules, 445 y 465 nm respectivamente, con alta resolución espacial. c La imagen compuesta codificada por color con rojo que indica niveles de oxigenación más altos en comparación con el verde. d, e, f, g Una segunda oreja de ratón en las cuatro longitudes de onda. h Una imagen de campo claro de la oreja del ratón. Los puntos de inyección intradérmica de Azul de Evan e ICG se pueden ver en las imágenes (f, g, h). f, g Los colorantes inyectados ingresan a los vasos linfáticos que presentan una estructura diferente a los vasos sanguíneos. i La imagen compuesta de las cuatro longitudes de onda. Podemos observar vasos sanguíneos y vasos linfáticos oxigenados (rojo), desoxigenados (verde) después de la captación de azul de Evan (cian) e ICG (púrpura) al mismo tiempo. Estos experimentos se repitieron diez veces de forma independiente con resultados similares. Todas las imágenes son proyecciones de máxima amplitud de imágenes reconstruidas. El verde es 445 nm, el rojo es 465 nm, el cian es 638 nm, el púrpura es 808 nm, la barra de escala es 1 mm.

A continuación, nuestro objetivo era identificar si FWMOT podía visualizar múltiples fracciones en tejido sin comprometer las características operativas como en el TD. Introdujimos contraste exógeno mediante inyección intradérmica de azul de Evan y verde de indocianina (ICG) y aplicamos FWMOT de 4 longitudes de onda para resolver simultáneamente arterias y venas (Fig. 3d, e) y vasos linfáticos revelados por la mejora del contraste (Fig. 3f, g). La Figura 3h muestra la imagen de campo claro correspondiente de la oreja del ratón. La imagen compuesta de cuatro longitudes de onda (Fig. 3i) permitió la visualización y colocalización de los vasos vasculares y linfáticos. En particular, el uso de un transductor de banda ultraancha permitió resolver las estructuras finas representadas por los vasos, así como las grandes áreas de absorción que se formaron alrededor de los sitios de inyección. Por lo tanto, FWMOT se puede usar de manera efectiva para realizar imágenes de OA con múltiples longitudes de onda simultáneamente in vivo con una adquisición de ~ 30 min, mientras que la misma implementación multiespectral en TD requiere ~ 2 h, lo que hace que dicha medición no sea práctica.

La aceleración de adquisición de FWM sobre TD demostrada en la Fig. 3 también apunta a un uso de FWMOT para detectar cambios rápidos simultáneamente usando múltiples longitudes de onda. Por lo tanto, aplicamos FWMOT para monitorear las fluctuaciones de oxigenación en la oreja del ratón durante una prueba de estrés con oxígeno in vivo. La figura 4a muestra la imagen OA compuesta de 2 longitudes de onda azules que revelan los vasos oxigenados y desoxigenados. Seleccionamos una línea de 2 mm (Fig. 4a; cuadro azul) para adquirir señales repetidamente (operación FWM continua) a una velocidad de ~ 4 Hz. Una exploración B (indicada por la letra (i) en la Fig. 4a) reveló una arteria (roja) y una vena (verde) en función de la profundidad. El desafío de oxígeno se proporcionó alternando la composición del gas respirable de 0,8 litros por minuto (lpm) de O2 al 100 % (Fig. 4b; "O2") a 0,6 lpm de O2 al 20 % más 0,2 lpm de CO2 (Fig. 4b; "Aire"). La Figura 4b traza la relación de la señal de longitud de onda 2 (S2) sobre la señal de longitud de onda 1 (S1) a lo largo del tiempo. La relación S2/S1 es indicativa de los cambios relativos de oxigenación en los vasos a lo largo del tiempo. Como era de esperar, se observó una mayor oxigenación en la arteria que en la vena durante todo el experimento. La oxigenación se redujo durante el suministro de aire y aumentó cuando se suministró O2 al 100%. Los niveles de oxigenación en la arteria aumentaron más rápido en respuesta al cambio del suministro de aire a O2 en comparación con la vena, lo que revela la dinámica esperada del suministro de oxígeno a los tejidos.

a Las imágenes OA en las longitudes de onda azules, que muestran vasos oxigenados (rojo) y desoxigenados (verde). Realizamos continuamente B-Scans en la región azul indicada en ay 'i' muestra una sección transversal de este tipo. La flecha verde y la región en 'i' indican la vena seleccionada, y la flecha roja y la región indican la arteria seleccionada. El verde es 445 nm, el rojo es 465 nm, la barra de escala es de 1 mm. b Los cambios en la relación entre la intensidad de la señal OA en la longitud de onda 2 (S2) y la de la longitud de onda 1 (S1) en el tiempo durante una prueba de estrés con oxígeno. La saturación de oxígeno es proporcional a la relación S2/S1. La saturación de oxígeno cambia más rápido en la arteria que en la vena, como se esperaba. c La tasa de extracción de oxígeno durante el mismo experimento. d La intensidad de la señal en las longitudes de onda 3 y 4 (S3 y S4 respectivamente) en la misma arteria y vena indicadas en a durante la inyección intravascular de los dos colorantes, azul de Evan e ICG. En ambos casos la intensidad de la señal aumenta primero en la arteria y luego en la vena. Estos experimentos se repitieron tres veces de forma independiente con resultados similares.

La tasa de extracción de oxígeno (OER en la Fig. 4c), una indicación del consumo de oxígeno por parte de las células, se calculó como OER = (Oca − Ocv)/Oca, donde Oca y Ocv son la saturación de oxígeno en la arteria y la vena centrales, respectivamente29 . Observamos que la OER disminuyó ligeramente poco después del período de suministro de aire, lo que sugiere una respuesta tardía en la oxigenación celular. Cuando se incrementó el suministro de oxígeno durante el segundo y tercer período de suministro de O2, se observó un aumento de la OER seguido de un retorno a los niveles normales, lo que sugiere que las células consumieron más oxígeno a medida que estuvo disponible. El experimento de prueba de estrés con oxígeno confirma que FWMOT es un método que se puede emplear para estudiar la dinámica de tejidos con una alta capacidad de localización, confirmado por inyección intravenosa de ICG y azul de Evan. Usando el mismo campo de observación de 2 mm, FWMOT registró la dinámica del agente de contraste a 638 y 808 nm (Fig. 4d). Observamos un patrón posterior a la inyección similar para ambos colorantes, que reveló dos picos distintivos antes de establecerse en un valor de referencia, indicativo de la dinámica de circulación de los colorantes en el sistema vascular. Además, resolvimos la aparición tardía de los agentes en la vena para ambos tintes, por lo que la señal observada aumentó a un ritmo menor, en comparación con la arteria, un patrón atribuido a la difusión del tinte en la red capilar del tejido.

Presentamos un método optoacústico basado en la multiplexación de frecuencia, que desafía la noción predominante de que las implementaciones de TD ofrecen el mejor rendimiento optoacústico. Al combinar las ventajas de la excitación TD, es decir, la excitación pulsada, con el análisis FD, FWMOT ofrece un rendimiento superior al TD o FD en la excitación de múltiples longitudes de onda. Aumentar el número de longitudes de onda (N) en TD compromete la profundidad de visión, la SNR o el tiempo total de adquisición. FWMOT puede proporcionar iluminación simultánea en múltiples longitudes de onda sin sacrificar ninguno de estos parámetros, lo que permite una SNR más alta por un factor de \(\sqrt{N}\) por longitud de onda, un tiempo de adquisición más corto por un factor de N o N veces más profundidad -de vista por longitud de onda en comparación con TDOA. Además, el uso de trenes de pulsos conduce a implementaciones prácticas de FWMOT al proporcionar las frecuencias discretas necesarias en el dominio de la frecuencia, al tiempo que evita la generación de señales FD por operación directa en el dominio de la frecuencia utilizando sistemas elaborados de modulación multifrecuencia.

Otro aspecto crítico en este documento fue no solo mostrar la superioridad teórica del método, sino también demostrar que puede conducir a implementaciones prácticas. Una tecnología habilitadora que permitió tal desempeño fue el uso de diodos láser de onda continua sobrecargados (CW-LD)26 que son inherentemente rentables, portátiles y compactos, lo que conduce a sistemas con el potencial de una alta difusión. Los LD son ideales para FWMOT y se pueden usar para reemplazar los láseres de estado sólido. Además de su factor de forma pequeño y su disponibilidad en múltiples longitudes de onda, los LD se pueden pulsar a tasas de repetición de pulso muy altas, igualando la capacidad FWMOT excepcionalmente óptima para multiplexar y promediar señales, aumentando la SNR. Los LD nuevos y más potentes que ingresen al mercado contribuirán a mejorar aún más el rendimiento de FWMOT, ofreciendo sistemas compactos y de bajo costo con un alto potencial de difusión para diversas aplicaciones9,27.

Las imágenes en cuatro longitudes de onda diferenciaron la vasculatura sanguínea de los vasos linfáticos in vivo, lo que redujo el tiempo de adquisición de las 2 h requeridas en TD a ~ 30 min. FWMOT también logró una tasa de adquisición cuatro veces mayor en comparación con TD al realizar B-Scans sobre la arteria y la vena principales, lo que permite monitorear los cambios relativos de oxigenación y calcular la tasa de extracción de oxígeno. Por lo tanto, FWMOT es particularmente adecuado para mediciones dinámicas o para experimentos que requieren anestesia, mejorando también la tasa de rendimiento asociada con respecto a las implementaciones de TD.

También existe un límite al número máximo de longitudes de onda utilizadas en FWMOT que depende del ancho de banda de detección de UST, el tiempo de adquisición o el número de promedios en los trenes de pulsos y la tasa de repetición de L1 utilizada en cada caso. Cuando frep,1 = 200 kHz, Np = 100 y el ancho de banda UST entre 22 y 78 MHz, el número máximo de longitudes de onda es 28 para FWMOT en comparación con solo 5 para implementaciones TD con los mismos parámetros operativos y un DoV de 1,5 mm por longitud de onda (ver la Nota complementaria 4). Cuantas más longitudes de onda se utilicen en FWMOT, mayor será el aumento de SNR por longitud de onda en comparación con TDOA. El uso de muchas longitudes de onda simultáneas sería particularmente atractivo para mejorar la especificidad de detección molecular de la espectroscopia OA.

En resumen, FWMOT permite obtener imágenes de alta SNR rápidas utilizando múltiples longitudes de onda simultáneamente sin comprometer el DoV y puede ofrecer una herramienta valiosa para estudiar procesos moleculares dinámicos, revolucionando la forma en que se realizarán imágenes OA multiespectrales en el futuro.

La Figura 5 presenta el sistema de mesoscopia optoacústica de exploración de trama multiespectral (RSOM) desarrollado para probar las ventajas de FWMOT. Matlab (Matlab 2016b, Mathworks, EE. UU.) se instaló en una PC, controlando el sistema (Fig. 5a). La PC controla el controlador de etapas de doble canal (C-867.260, Physik Instrumente, Alemania) que impulsa las etapas duales x-y colocadas en el cabezal de escaneo (Fig. 5c) y está sincronizado con dos generadores de forma de onda arbitraria (AWG, 33522B, Keysight, Estados Unidos). Los AWG activan los controladores de diodo láser y proporcionan un pulso de sincronización a la tarjeta de adquisición de datos (DAQ, 12 bits, 200 MS/s, Razor Express 14x2 Compuscope, Dynamic Signals LLC, EE. UU.) para la adquisición sincrónica de la señal. La salida de luz del sistema de iluminación se dirige al cabezal de escaneo, y una pequeña parte ingresa a un fotodiodo (DET10A2/M, Thorlabs, EE. UU.). La señal del fotodiodo se filtra de forma analógica (BLP-90+, Minicircuits, EE. UU.) y se graba para monitorear las fluctuaciones de energía de pulso a pulso y la fluctuación de tiempo, corregida para ambas durante el procesamiento posterior de la señal. La señal OA del UST se amplifica con un amplificador de ganancia de 60dB (Miteq AU-1291-R, Miteq, EE. UU.) y se filtra analógicamente (BLP-90+ y ZFHP-1R2-S+, Minicircuits, EE. UU.) antes de ser digitalizada por el DAQ para evitar el alias.

a El esquema del sistema desarrollado mostrando las conexiones eléctricas y ópticas de las diferentes partes del sistema. b El sistema de iluminación de diodos láser. Cada diodo láser se conecta a un controlador de diodo láser separado y se enfoca en una fibra multimodo con un sistema de 2 lentes. Los cuatro diodos láser están acoplados en un combinador de potencia de fibra de 4 × 4 y cada salida del combinador tiene ~25 % de la potencia de cada entrada, combinando todas las longitudes de onda. c El cabezal de escaneo del sistema RSOM que consta de las etapas de escaneo x–y (i), el soporte impreso en 3D (ii), el transductor de ultrasonido (iii) y las cuatro fibras de salida del combinador de energía de fibra (iv) dispuestas en un patrón circular alrededor del UST. Componentes de imagen adaptados con permiso de los propietarios de los derechos de autor; los componentes optomecánicos en b se obtienen de Thorlabs Inc. y las etapas de escaneo (U-723 XY) en c de Physik Instrumente GmbH (https://www.physikinstrumente.com/en/products/xy-stages/u-723- piline-xy-stage-1000583/#descargas).

El sistema de iluminación (Fig. 5b) consta de cuatro diodos láser CW que fueron saturados con cuatro controladores de diodos láser de pulso corto y alta corriente desarrollados previamente26. En resumen, la corriente máxima de los LD aumenta brevemente (durante nanosegundos) a >40 veces su máximo absoluto CW, lo que permite que los LD proporcionen una potencia máxima hasta 27 veces mayor que el límite máximo absoluto especificado por el fabricante. Los diodos láser utilizados en este trabajo son el LDM-445-6000 (LaserTack, Alemania) que emite a 445 nm, el LDM-465-3500 (LaserTack, Alemania) que emite a 465 nm, el HL63283HG (Ushio, Japón) que emite a 638 nm. nm y el K808D02FN (BWT, China) que emiten a 808 nm, denominados láser 1, láser 2, láser 3 y láser 4 respectivamente. Cada diodo láser está enfocado en una fibra multimodo. Para colocar cada diodo láser en una platina X–Y manual (CXY1, Thorlabs, EE. UU.), se coloca una lente colimadora (C340TMD, Thorlabs, EE. UU.) delante de él en una platina z manual (SM1Z, Thorlabs, EE. UU. ), seguido de una lente de enfoque (C560TME, Thorlabs, EE. UU.) que se mantiene estable y la fibra en etapa axial-y (CXY1, Thorlabs, EE. UU.). La fibra con un diámetro de núcleo de 200um y 0.22NA era una de las 4 entradas del combinador de potencia de fibra 4x4. Las cuatro salidas del combinador de fibra (MPC-4-M21-M41-P23, Lasfiberio, China) contienen ~25 % de la potencia de entrada de cada fibra de entrada y también son fibras multimodo con un núcleo de fibra de 200 µm y 0,22 NA. Una de las salidas está conectada a un divisor de 95-5 % hecho a medida (LTL 500-93310-95-1, LaserComponents Germany GmBH, Alemania) y el 5 % de fibra se conectó al fotodiodo. Las 3 salidas del combinador de potencia y el 95% de fibra del divisor se terminaron con casquillos de 1,25 mm (SFLC230, Thorlabs, EE. UU.) y se dirigieron al cabezal de escaneo.

El cabezal de escaneo (Fig. 5c) consta de la platina x–y (U-723 XY, Physik Instrumente, Alemania), el soporte impreso en 3D, el transductor de ultrasonido (UST, HFM23, Sonaxis, Francia) con una frecuencia central de 50 MHz y 112% de ancho de banda relativo, 3 mm de distancia focal y 0,5 NA, y las cuatro fibras de salida dispuestas en un patrón circular alrededor del UST. La salida de las cuatro fibras está diseñada para cruzarse en el punto focal del UST para lograr una máxima densidad de energía en la muestra.

El escaneo y la grabación se realizan con un movimiento de barrido utilizando el controlador de escenarios como maestro en el sistema. La etapa x se mueve en línea recta con velocidad constante. Cuando la etapa x ha recorrido una distancia específica, igual al tamaño del paso, el controlador de etapas envía una señal a los AWG para activar los diodos láser. Cada diodo láser se activa mediante un tren de pulsos con frecuencia de repetición frep,1–frep,4 para cada diodo láser y un número Np1–Np4 de pulsos en cada punto (A-Scan) en el B-Scan. Una vez que el escenario ha recorrido la distancia deseada, se completa el B-Scan y los escenarios dejan de moverse. La etapa y se mueve a la siguiente posición y y la etapa x ahora puede realizar el siguiente B-Scan en la dirección opuesta. Para la excitación FWMOT usamos frep,1 = 200,000 Hz, frep,2 = 200,125 Hz, frep,3 = 200,250 Hz y frep,4 = 200,375 Hz y Np1 = 100 y Np2 = Np3 = Np4 = 101 pulsos para láseres 1, 2, 3 y 4, respectivamente. Para obtener una derivación detallada de estos valores, consulte la Nota complementaria 2.

Registramos los espectros de emisión de los 4 diodos láser utilizados en el diodo láser multiespectral RSOM con un espectrómetro (USB4000, OceanOptics, Reino Unido) y las longitudes de onda de emisión máxima fueron 444,3, 460,1, 636,8, 804,9 nm con una variación de 1,6, 1,7, 1,9 , 2,2 nm respectivamente y un nivel de confianza de R2 superior a 0,96 para todos los casos.

Además, la energía por pulso en las muestras se midió con un medidor de potencia térmica estabilizada (PM160T, Thorlabs, EE. UU.) y se calculó como 189, 137, 142, 153 nJ por pulso para los láseres 1, 2, 3, 4, respectivamente. El ancho de pulso se estimó en 6,7, 6,7, 10,2, 10,2 ns de ancho completo a la mitad del máximo (FWHM) para cada láser, respectivamente. Usando una cámara USB CCD (daA1920-30 µm; Basler AG, Alemania) se midió el punto de iluminación en la superficie de la muestra para que fuera un círculo con un diámetro de ~1 mm. La Tabla 1 presenta un resumen de las características de emisión y pulsación de LD para la operación FWMOT como se presentó anteriormente.

Para comparar la excitación FD OA con la FWMOT, utilizamos un diodo láser de 450 nm acoplado a fibra (FBLD-450-0.8W-FC105-BTF; Frankfurt Laser Company, Alemania) conectado a un controlador láser analógico (BFS-VRM 03 HP; Picolas, Alemania). La fibra de salida del láser se bombeó a una de las fibras de entrada del combinador de fibra 4 × 4, de modo que la iluminación de la muestra sea idéntica para la excitación FD y el sistema de excitación FWMOT.

Para calcular la relación señal-ruido (SNR) usamos la siguiente fórmula, 10 * log10(S/N), donde S es la intensidad de la señal y N la desviación estándar del ruido de fondo.

La adquisición de imágenes se produce en un gran campo de visión (10 × 10 mm2) y con un tamaño de paso de exploración de 10 µm para que sea mucho menor que la resolución lateral del sistema. Las señales con resolución temporal detectadas en cada posición de exploración corresponden a la integración de ondas esféricas acústicas que se originan en los absorbentes ópticos iluminados dentro del ángulo de detección del transductor. Por lo tanto, las imágenes sin procesar obtenidas directamente del sistema están muy borrosas y requieren un procesamiento adicional para obtener imágenes de alto contraste y alta resolución. Para ello, se implementa un algoritmo de retroproyección en el dominio de Fourier30,31 para recuperar una imagen (acústicamente) limitada por difracción. A continuación, la imagen resultante se corrige mediante la respuesta de impulso del sistema32 y se procesa posteriormente con un filtro de vasija para fines de visualización33. Los datos sin procesar de un solo B-Scan no permiten la reconstrucción de imágenes en 3D. Por lo tanto, se desarrolló una versión simplificada del algoritmo de retroproyección, que opera en dos dimensiones y aproxima el campo de sensibilidad de los transductores como una sección cónica solo a lo largo de la dirección B-Scan.

Para calcular la resolución espacial del sistema, tomamos una imagen de un objetivo de resolución (una estrella de Siemens) utilizando las 4 longitudes de onda. Los resultados se presentan en la Fig. 3 complementaria, que muestra las imágenes OA reconstruidas del objetivo de resolución en las cuatro longitudes de onda, así como la imagen compuesta en coordenadas polares. La resolución espacial viene dada por el radio más pequeño en el que todas las líneas pueden resolverse bien (Fig. 3h complementaria), que es de 38 µm para todas las longitudes de onda.

La hemoglobina tiene un amplio espectro de absorción en el rango visible e infrarrojo cercano con una mayor absorción en las longitudes de onda más bajas del espectro. La absorción de hemoglobina desoxigenada es mayor que la absorción de hemoglobina oxigenada a 444 nm. La absorción de hemoglobina oxigenada es mayor que la absorción de hemoglobina desoxigenada a 460 nm. La absorción total de hemoglobina en las longitudes de onda 1 y 2 es mucho mayor que en las longitudes de onda 3 y 4. Debido a la baja energía de salida de los diodos láser, esto es suficiente para suponer que solo detectamos señales de OA de la hemoglobina en las longitudes de onda 1 y 2. Esto se ha confirmado a partir de los experimentos in vivo con orejas de ratón. Además, podemos estimar los cambios relativos de la saturación de oxígeno34 calculando la relación entre la intensidad de la señal de la longitud de onda 2 y la de la longitud de onda 1, S2/S1, donde una relación más alta indica una saturación de oxígeno más alta.

Para inducir el contraste y aumentar la SNR en las longitudes de onda 3 y 4 utilizamos dos colorantes, Evan's Blue (Sigma-Aldrich, Alemania) e ICG (VERDYE, Alemania). El azul de Evan tiene un pico de absorción a 640 nm y un mínimo a 740 nm35, lo que lo convierte en el tinte apropiado para mejorar el contraste para la longitud de onda 3, ya que esta es la única longitud de onda en la que podemos detectar señales OA. El ICG en el plasma sanguíneo tiene un pico de absorción a alrededor de 810 nm y una baja absorción a 637 nm36, por lo que es apropiado inducir el contraste OA en la longitud de onda 4 con un contraste mínimo en la longitud de onda 3 y sin contraste en las otras longitudes de onda, confirmado por los experimentos en el oído del ratón. .

Usando los valores mencionados anteriormente (Tabla 1) para cada diodo láser y una velocidad de escaneo de 10 mm/s para un tamaño de paso de escaneo de 10 μm, podemos calcular la exposición de la muestra. Se calcula que la exposición total de la muestra para la iluminación simultánea con las cuatro longitudes de onda es de 19,8 µJ/cm2 por pulso y una exposición media de 3,96 W/cm2, muy por debajo de los límites de MPE de 20 mJ/cm2 y 18 W/cm2 impuestos por la Instituto Nacional Estadounidense de Estándares37. Se ha demostrado que los efectos no lineales en OA están presentes en densidades de alta energía superiores a ~7 mJ/cm2 38. La exposición total de la muestra aquí fue inferior a 20 µJ/cm2, incluso en el caso de iluminación simultánea con todas las longitudes de onda. Por lo tanto, la energía depositada en este estudio fue mucho más baja que el umbral para los efectos no lineales.

Para nuestros experimentos, empleamos dos ratones Athymic nude-Foxn1nu hembra de 5 a 6 semanas de edad (Envigo, Alemania). Durante todas las mediciones, los ratones se anestesiaron con isoflurano al 1,6 % (cp-Pharma, Alemania) con un flujo de gas portador de 0,8 lpm y se mantuvo la temperatura corporal con una lámpara de calor infrarroja y una placa calefactora.

El primer ratón se utilizó para los experimentos presentados en la Fig. 3. Los vasos linfáticos del oído se resaltaron mediante la administración intradérmica de 5 µl de ICG (5 mg/ml) y 5 µl de azul de Evan (1 %) en la punta de la oreja del ratón. Se administró ICG ~ 30 min y azul de Evan ~ 10 min antes de comenzar la obtención de imágenes para garantizar el drenaje linfático de los colorantes.

Se utilizó un segundo ratón para los experimentos que se muestran en la Fig. 4. Para el experimento de estrés por oxígeno, suministramos diferentes combinaciones de gas portador de isoflurano o condiciones de respiración a través de una máscara nasal. El ratón respiraba alternativamente 0,8 lpm de oxígeno al 100 % (O2) y una combinación de 0,6 lpm de aire medicinal (20 % de oxígeno) más 0,2 lpm de dióxido de carbono CO2 (aire). Para el experimento de difusión de colorante, primero adquirimos los datos de fondo y, después de 3 minutos, inyectamos por vía intravenosa 100 µl de solución de azul de Evan al 1 % y, después de otros 3 minutos, 100 µl de solución ICG de 5 mg/ml. Ambos ratones fueron sacrificados inmediatamente después de la toma de imágenes por dislocación cervical.

Todos los experimentos con ratones se realizaron de acuerdo con el comité de Salud y Cuidado Animal de la Alta Baviera, Alemania (Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-14-88 y Az. ROB-55.2-2532.Vet_02-18-120). Los ratones se mantuvieron en un sistema de jaula ventilada individual (Tecniplast, Alemania) a 22° de temperatura ambiente, ~50% de humedad relativa y con un ciclo regular día/noche de 12 h en nuestras instalaciones para ratones libres de patógenos específicos (SPF) en el Centro de Investigación Traslacional del Cáncer de la Universidad Técnica de Munich (TranslaTUM).

Uno de los autores se ofreció como voluntario para este estudio para obtener imágenes de su mano. Después de consultar con la Comisión de Ética de TUM, no fue necesaria una aprobación de ética formal. Se obtuvo y archivó el consentimiento informado del participante. El participante es un hombre blanco de 30 años. La adquisición de imágenes se produjo en un campo de visión de 5 × 5 mm2 y con un tamaño de paso de exploración de 10 µm. Las imágenes OA reconstruidas se presentan en la Fig. 2 complementaria.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de la señal optoacústica sin procesar para validar el algoritmo de tomografía optoacústica multiplexada de longitud de onda de frecuencia, los datos de imágenes sin procesar de ratones y humanos, los datos B-Scan sin procesar de la prueba de estrés de oxígeno y los experimentos de inyección de ICG y Evan's Blue que se generaron en este estudio han sido depositado en la base de datos de Zenodo bajo el código de acceso: https://doi.org/10.5281/zenodo.6770729.

Los autores declaran que para la recolección de datos se utilizó el software disponible comercialmente de GaGe (Compuscope Driver Version 5.04.34, Dynamic Signals LLC, EE. UU.) y Matlab 2016b (Matlab, Mathworks, EE. UU.). El análisis de datos se realizó en Matlab utilizando sus funciones integradas. El algoritmo de tomografía optoacústica multiplexada de longitud de onda de frecuencia ha sido patentado y está disponible a discreción del autor correspondiente.

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La investigación que condujo a estos resultados recibió financiación del Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF), Bonn, Alemania (Proyecto Sense4Life, 13N13855) (VN), del Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco de la investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea. programa bajo el acuerdo de subvención No 694968 (PREMSOT) (VN) y del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea bajo el acuerdo de subvención No 732720 (ESOTRAC) (VN) y No 862811 (RSENSE) (VN). Nos gustaría agradecer al Dr. Sergey Sulima y al Dr. Robert Wilson por su ayuda para escribir el manuscrito.

Financiamiento de acceso abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Presidente de Imágenes Biológicas en el Instituto Central para la Investigación Traslacional del Cáncer (TranslaTUM), Escuela de Medicina, Universidad Técnica de Munich, Munich, Alemania

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian y Vasilis Ntziachristos

Instituto de Imágenes Biológicas y Médicas, Helmholtz Zentrum München, Neuherberg, Alemania

Antonios Stylogiannis, Ludwig Prade, Sarah Glasl, Qutaiba Mustafa, Christian Zakian y Vasilis Ntziachristos

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AS y LP desarrollaron el sistema RSOM de múltiples longitudes de onda. LP desarrolló la técnica de procesamiento de señales multiplexadas de longitud de onda de frecuencia. AS siguió trabajando en el algoritmo multiplexado de longitud de onda de frecuencia, desarrolló la fuente de excitación CW-LD sobrecargada, realizó los experimentos de imágenes y procesó los datos. SG ayudó a AS en la realización de los experimentos con ratones. QM reconstruyó las imágenes optoacústicas. CZ y VN ayudaron con extensos debates y orientación en la realización de esta investigación.

Correspondencia a Vasilis Ntziachristos.

VN es fundador y propietario de acciones de sThesis GmbH, iThera Medical GmbH, Spear UG e i3 Inc. Los demás autores no tienen intereses en competencia.

Nature Communications agradece a Frans Harren y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

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Reimpresiones y permisos

Stylogiannis, A., Prade, L., Glasl, S. et al. Tomografía optoacústica multiplexada de longitud de onda de frecuencia. Nat Comun 13, 4448 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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Recibido: 06 julio 2021

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 01 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32175-6

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