Procesamiento de nocicepción distinto en las regiones disgranulares y de barril de la corteza somatosensorial del ratón

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3622 (2022) Citar este artículo

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La nocicepción, un aspecto discriminativo somático del dolor, está representado, como el tacto, en la corteza somatosensorial primaria (S1), pero la separación y la interacción de las dos modalidades dentro de S1 siguen sin estar claras. Aquí, mostramos un procesamiento nociceptivo y táctil espacialmente distinto en el campo de barril granular (BF) y la región disgranular adyacente (Dys) en el ratón S1. Los registros simultáneos de la actividad multiunitaria en las subregiones revelaron que las neuronas Dys responden más a las entradas nocivas, mientras que las neuronas BF prefieren las entradas táctiles. En el nivel de una sola neurona, la información nociceptiva se representa por separado de la información táctil en la capa Dys 2/3. Por el contrario, ambas modalidades parecen converger en las neuronas individuales de la capa 5 de cada región, pero en diferente medida. En general, estos hallazgos muestran un procesamiento específico de la capa de información nociceptiva y táctil entre Dys y BF. Además, demostramos que la actividad Dys, pero no la actividad BF, está críticamente involucrada en el comportamiento similar al dolor. Estos hallazgos brindan nuevos conocimientos sobre el papel del procesamiento del dolor en S1.

La corteza somatosensorial primaria (S1) juega un papel central en el procesamiento de la información táctil1. La representación táctil en S1 está ordenada de forma somatotópica2. Por otro lado, S1 es responsable de los aspectos discriminativos somáticos del procesamiento del dolor, como la ubicación, la intensidad y la calidad del dolor3,4,5,6,7,8,9,10. S1 recibe información nociceptiva talamocortical11 y la transmite a otras áreas corticales relacionadas con el dolor, como la corteza cingulada anterior, que es responsable de los aspectos afectivos del dolor12,13. S1 también modula entradas nocivas a través de las vías corticotrigeminal14 y corticoespinal15 en condiciones de dolor agudo y crónico. Por lo tanto, S1 puede verse como un centro de red de procesamiento del dolor y un objetivo para las intervenciones para controlar el dolor. Sin embargo, no está claro cómo S1 procesa la información nociceptiva y la información táctil somática de manera distintiva.

Mouse S1 se divide en dos subregiones en función de su citoarquitectura: la región granular conocida como campo de barril (BF), que se identifica por grupos únicos de neuronas de capa (L4), y la región disgranular adyacente (Dys), que tiene mal definido L46,16. Se cree que las dos subregiones son funcionalmente diferentes. Por ejemplo, BF es el centro para procesar la información táctil de los bigotes17,18,19, mientras que Dys recibe información propioceptiva de estimulaciones musculares profundas o rotaciones articulares20,21. En la nocicepción, las neuronas BF en capas más profundas reciben entradas nocivas11,22,23. De manera similar, las neuronas Dys en las capas más profundas responden a estímulos nocivos y pruriceptivos24,25. Sin embargo, aún se desconoce cómo cada subregión procesa la información nociceptiva con/sin información táctil porque falta una comparación directa entre las dos subregiones.

Aquí, encontramos que la información nociceptiva y táctil tiende a representarse por separado en Dys y BF, respectivamente, al registrar simultáneamente ambas subregiones. Dys también se activó predominantemente en condiciones de dolor neuropático producido por lesión del nervio periférico. Como reflejo de la representación espacialmente distinta de la nocicepción, la inhibición optogenética de la actividad neuronal de Dys, pero no de BF, redujo el comportamiento similar al dolor inducido por entradas nocivas. Por lo tanto, aclaramos un papel funcional distinto en el procesamiento del dolor en Dys, que genera un comportamiento de escape adecuado de las entradas nocivas.

Primero, comparamos las propiedades de respuesta entre Dys y BF durante estímulos de calor nocivos (noxH; 45–50 ° C) aplicados a una almohadilla de bigotes (Fig. 1a). Aunque los tabiques dentro de BF pertenecen a la región disgranular en términos de citoarquitectura, designamos la zona disgranular que rodea a BF como Dys. Registramos actividades multiunitarias (MUA) simultáneamente desde las neuronas Dys y BF en L2/3, L4, L5a y L5b. El MUA en Dys aumentó en todas las capas registradas cuando la temperatura del dispositivo Peltier alcanzó un rango nocivo (45–50 °C), mientras que las respuestas difirieron entre las capas en BF: MUA a noxH no aumentó en L2/3 o L4 pero aumentó ligeramente en L5a (Fig. 1b). Para evaluar la preferencia por noxH, se calculó la relación señal-ruido (S/N; ver Métodos). La respuesta a noxH (marcada S, región sombreada en beige en la Fig. 1b) se usó como señal, y la respuesta a un rango de calor inocuo (33–45 °C, etiquetada como N, región sombreada en gris en la Fig. 1b) fue utilizado como el ruido. Las comparaciones de pares neuronales registrados simultáneamente mostraron que las neuronas Dys responden más a noxH que las neuronas BF (Fig. 1c, P = 0.0056 para L2/3, 0.0056 para L4 y 0.049 para L5a, n = 8 animales). Al comparar los valores de S/N para las mismas capas entre Dys y BF, la S/N en Dys fue significativamente mayor que en BF en L2/3 (P = 0,89 × 10−4, prueba de comparaciones múltiples, Fig. 1d). Dentro de BF, la S/N fue significativamente mayor en L5a que en L2/3 (P = 0,03, Fig. 1d). Esta diferencia entre capas para las respuestas de noxH en BF es consistente con estudios previos22,23,26. Esta tendencia también se observó cuando se utilizó la respuesta del dispositivo Peltier a temperatura de estado estable (alrededor de 30 °C) como señal de ruido para calcular la S/N. Juntos, el MUA de Dys mostró una mayor sensibilidad a noxH que BF (Fig. 1e). También examinamos la expresión de c-Fos, un marcador de la actividad neuronal, en el área dentro de S1 que responde a la entrada nociva después de la inyección de capsaicina en la almohadilla del bigote (Figura complementaria 1a). Para diferenciar entre Dys y BF, nos inmunoteñimos conjuntamente con NeuN y VGluT2, marcadores para neuronas y terminales talamocorticales, respectivamente (Fig. 1b complementaria). El número de neuronas positivas para c-Fos aumentó significativamente en L4 de Dys (P = 0.0027) y L5a de BF (P = 0.0249, Fig. 1c complementaria). Por lo tanto, confirmamos que las entradas nocivas activaron las capas superficiales en Dys y L5a en BF.

una configuración para grabaciones simultáneas de Dys y BF mientras se aplican estímulos de calor nocivos (noxH) a la almohadilla del bigote izquierdo. Una sección del cerebro que muestra pistas de electrodos (DiI, rojo). La tinción de VGluT2 (verde) muestra el borde de Dys y BF. Barra de escala, 500 μm. b PSTH de grabaciones MUA representativas a noxH en L2/3, 4 y 5a de Dys y BF. Las áreas sombreadas indican regiones para calcular las relaciones S/N. c Un diagrama de dispersión de S/N de actividades multiunitarias registradas simultáneamente en respuesta a un estímulo noxH. P = 0,000023 para L2/3 (n = 25), 0,0056 para L4 (n = 17), 0,049 para L5a (n = 16) y 0,69 para L5b (n = 6) mediante la prueba bilateral de rangos con signo de Wilcoxon. La diagonal indica unidad. d Comparación estadística de respuestas S/N a noxH. *P = 0,030, **P = 0,89 × 10−4 por la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Sidak; n = 8 animales. Box plots (mediana con los percentiles 25 y 75). Los puntos de datos más allá de los bigotes se muestran mediante puntos. e Un diagrama resumen que indica las regiones nociceptivas en S1.

A continuación, evaluamos la preferencia de respuesta a los estímulos táctiles comparando el S/N en respuesta a las desviaciones de los bigotes (ver Métodos). Las neuronas en BF respondieron con precisión al inicio de cada desviación del bigote, mientras que las de Dys no lo hicieron (Fig. 2a, b). La S/N a las desviaciones de los bigotes fue mayor en BF que en Dys en cada capa (Fig. 2c, d), lo que indica que las respuestas de BF fueron más fuertes que las respuestas de Dys a los estímulos táctiles (Fig. 2e). Dado que la almohadilla del bigote fue estimulada directamente por el calor, probamos su respuesta a la estimulación táctil colocando un pincel en la almohadilla del bigote (esta es la posición equivalente al estímulo de calor) y confirmamos que BF prefiere los estímulos táctiles a Dys (Fig. 2).

una configuración para registrar las respuestas de Dys y BF a la estimulación táctil de los bigotes. El área sombreada indica el tiempo utilizado como señal (S) y ruido (N) para calcular la S/N de la entrada táctil. b Ejemplos de PSTH de MUA a estímulos táctiles en L2/3, 4 y 5a de Dys y BF registrados al mismo tiempo (ver también Fig. 1e). c Un diagrama de dispersión de S/N de MUA registrado simultáneamente para estímulos táctiles. P = 0,0038 para L2/3 (n = 25), 0,028 para L4 (n = 17), 0,0002 para L5a (n = 16) y 0,063 para L5b (n = 6) mediante la prueba bilateral de rangos con signo de Wilcoxon . La diagonal indica unidad. d S/N a un estímulo táctil fue mayor en BF L2/3. **P = 5,4 × 10−4 por la prueba de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Sidak; n = 8 animales. Box plots (mediana con los percentiles 25 y 75). Los puntos de datos más allá de los bigotes se muestran mediante puntos. e Un diagrama de resumen que indica las regiones de preferencia táctil en S1.

Los resultados del análisis MUA indicaron que existen algunos sesgos espaciales para el procesamiento de información nociceptiva entre Dys y BF (Fig. 1). Por lo tanto, examinamos la especificidad de modalidad de neuronas individuales en dos subregiones. L2/3 y 5 son las capas de salida corticales que establecen conexiones con las cortezas motora y cingulada anterior, que están implicadas en el comportamiento similar al dolor13,27. Los histogramas de tiempo de periestímulo (PSTH) de neuronas bien aisladas en L2/3 registradas simultáneamente desde las dos subregiones se muestran en la Fig. 3a; las neuronas registradas se ordenaron por el momento de la respuesta máxima a un estímulo de calor. En Dys L2/3, la inclinación de las respuestas máximas a un estímulo de calor aumentó dentro del rango de calor nocivo, lo que indica que la mayoría de las neuronas Dys respondieron al calor nocivo. Por el contrario, solo unas pocas neuronas respondieron en BF L2/3 (recuadro blanco en la Fig. 3a, columna izquierda). Por otro lado, muchas neuronas BF L2/3 respondieron bien a los estímulos táctiles. En particular, las neuronas nocivas que responden al calor en Dys L2/3 no respondieron a los estímulos táctiles (recuadro blanco en la Fig. 3a, columna derecha).

a PSTH para las respuestas de las mismas neuronas en L2/3, L5a y L5b al calor nocivo (noxH) (izquierda) y estímulos táctiles (derecha). 50 ms/bin para el estímulo térmico y 5 ms/bin para el estímulo táctil. Cada fila se clasificó por el tiempo de respuesta pico para noxH, y la tasa de disparo se normalizó por la respuesta pico (áreas encuadradas) en cada fila. b Valores medios de los histogramas en los paneles a y b ordenados según el S/N a noxH y estímulos táctiles: células nociceptivas, táctiles, integradoras (nociceptivas y táctiles) y no reactivas (ninguna) (ver Fig. 3 complementaria) . *P < 0,05 frente a no reactivo (prueba bilateral de Kruskal-Wallis seguida de la prueba de Tukey). Los sombreados indican SEM. c Distribuciones de tipo de celda en L2/3, L5a y L5b de cada área y un diagrama resumen. d Distribuciones de los umbrales térmicos determinados a partir de la temperatura a la que las respuestas neuronales alcanzaron el 80 % de la tasa máxima de picos. En L2/3 y L5b, las neuronas Dys se ajustaron al calor nocivo, mientras que las neuronas BF respondieron a varias temperaturas (*P = 0,013, **P = 0,005, prueba de dispersión de Ansari-Bradley de dos muestras). e Porcentajes de neuronas para las que se suprimieron las respuestas (S/N < 1). ***P = 5,4 × 10−8, 2 × 2 χ2 prueba entre BF y Dys.

La inclinación de las respuestas máximas a los estímulos térmicos aumentó dentro del rango de calor nocivo en ambas regiones en capas más profundas (recuadros blancos en L5a y L5b en la Fig. 3a, columna izquierda). Esta tendencia indica que las neuronas nociceptivas aumentaron en capas más profundas. A excepción de Dys L5a, las neuronas nociceptivas en L5 tendían a responder también a los estímulos táctiles (cuadros blancos en la Fig. 3a, columna derecha). Por lo tanto, las neuronas Dys en L2/3 procesan la información nociceptiva por separado de la información táctil, mientras que las neuronas en L5 tienden a responder tanto a las entradas táctiles como a las nocivas.

Para cuantificar estas observaciones, clasificamos las neuronas en tipos nociceptivos, táctiles, integradores y no reactivos de acuerdo con la S / N a noxH y estímulos táctiles (Fig. 3b y Fig. 3 complementaria). Las distribuciones de S / N se agruparon de acuerdo con la mediana de S / N para todas las neuronas registradas (1.46 para nociceptivas y 1.81 para táctiles, Figura complementaria 3b, d, f, g). Además, las PSTH normalizadas de las neuronas clasificadas de acuerdo con estos valores representaban las características de cada grupo de neuronas (Fig. 3b): las neuronas de tipo nociceptivo respondieron al calor nocivo pero no a los estímulos táctiles, las neuronas de tipo táctil respondieron a las entradas táctiles pero no a los estímulos táctiles. calor nocivo y las neuronas de tipo integrador respondieron a ambos estímulos. Por lo tanto, utilizamos la mediana S/N como valor de corte para la clasificación. De acuerdo con esta clasificación, se calculó el porcentaje de neuronas de cada tipo en cada subregión (Fig. 3c). De acuerdo con la población PSTH (Fig. 3a), en la mayoría de las neuronas en L2/3, la información nociceptiva se procesó por separado en Dys mientras que la información táctil se procesó en BF. Además, muchas neuronas de tipo táctil en Dys L2/3 tenían latencias de inicio relativamente más largas a la estimulación táctil que las de BF L2/3 (Fig. 4 complementaria), lo que sugiere que estas neuronas reciben información táctil de BF. Por el contrario, la latencia de inicio de las neuronas de tipo integrador en L2/3 de ambas regiones fue más larga (Fig. 4 complementaria).

En las capas más profundas, la información nociceptiva y táctil se integró en la mayoría de las neuronas de ambas subregiones (Fig. 3c, abajo).

Dado que las neuronas Dys y BF en las capas más profundas respondieron principalmente a la estimulación térmica nociva, también examinamos las respuestas neuronales a los estímulos mecánicos nocivos22. Examinamos las respuestas evocadas a un estímulo mecánico nocivo de von Frey (10 g) (Fig. 5 complementaria). El MUA de Dys y BF en L5b aumentó con la aplicación de un filamento de von Frey ponderado de 10 g (Fig. 5a complementaria). El MUA de BF L5b y Dys L5b alcanzó una respuesta máxima cuando el filamento de von Frey se dobló (es decir, la almohadilla del bigote se estimuló a 10 g, Fig. 5b complementaria). La inclinación de las respuestas máximas a la estimulación nociva aumentó en Dys L5b y BF L5b (Fig. 5b complementaria), lo que indica que muchas neuronas dentro de las capas más profundas también responden a la estimulación mecánica nociva.

En la población de PSTH (Fig. 3a), el inicio de la respuesta a los estímulos térmicos varió entre las neuronas, especialmente en BF L2/3 y L5b, lo que indica que las neuronas respondieron a diversas temperaturas. Por lo tanto, examinamos la sensibilidad a la temperatura desde el umbral térmico (80% de respuesta máxima) de las neuronas en respuesta al estímulo térmico (Fig. 3d). Las neuronas L2/3 en ambas regiones comenzaron a responder a temperaturas inocuas (–44 °C). Las distribuciones del umbral térmico de las neuronas Dys, pero no de las neuronas BF, se acumularon significativamente alrededor del rango de calor nocivo en L2/3 (P = 0,013) y L5b (P = 0,0051) (Fig. 3d). Estos datos sugieren que las neuronas Dys están bien sintonizadas con la temperatura del calor nocivo, mientras que las neuronas en BF L2/3 y L5b codifican temperaturas cutáneas28,29.

Los PSTH promedio (Fig. 3b) muestran que las actividades neuronales de las neuronas táctiles y no reactivas fueron suprimidas por noxH. Debido a que la S/N de estas neuronas fue <1, estimamos el porcentaje de neuronas suprimidas por noxH en cada región. En BF L2/3, el 60% de las neuronas fueron suprimidas por noxH (Fig. 3e). Este porcentaje es significativamente mayor que el de Dys (22 %, P = 5,4 × 10−8). Estos datos pueden explicar el mecanismo neural subyacente a los déficits en la capacidad discriminativa perceptiva táctil bajo la condición de dolor30,31.

En resumen, los datos muestran que la información nociceptiva se procesa por separado de la información táctil en la capa superficial de Dys y BF y tiende a integrarse en capas más profundas. La diferencia en los umbrales térmicos indica que Dys procesa la entrada de calor nocivo y BF es responsable de la codificación de temperatura.

A continuación, examinamos si la actividad de Dys implica el procesamiento del dolor en condiciones fisiopatológicas. Se ha propuesto que S1 se activa bajo dolor crónico12,13,32,33 y que la lesión de fibras nerviosas periféricas provoca reorganización somatotópica e hipersensibilidad mecánica34,35,36,37,38,39. Por lo tanto, aplicamos un modelo de neuralgia del trigémino mediante la ligadura del nervio infraorbitario (ION) e investigamos cómo cambia la actividad cortical espacial en S1 durante el desarrollo de la alodinia mecánica. Con este objetivo, utilizamos un hilo quirúrgico absorbible (ver Métodos), que nos permitió observar el estado de alodinia mecánica y el estado de recuperación en el mismo animal.

Primero examinamos el curso temporal del desarrollo de la alodinia mecánica mediante la ligadura ION, que se evaluó mediante el umbral de escape en la prueba del filamento de von Frey. Los ratones mostraron alodinia cuando la resistencia a la tracción del hilo quirúrgico era ~50 % y se recuperaron cuando la resistencia a la tracción se redujo al 0 % de la fuerza máxima (Fig. 6 complementaria).

A continuación, registramos las señales intrínsecas inducidas por la estimulación de los bigotes de forma continua del mismo animal antes y durante el estado de alodinia mecánica (POD7) y el estado de recuperación (POD21, Fig. 4a, b). Se observaron señales intrínsecas evidentes en BF inducidas por estimulación de bigotes antes de la ligadura (Fig. 4b, izquierda). En el estado de alodinia (POD7), la señal en BF desapareció pero aumentó en la región adyacente (Fig. 4b, centro), aunque el contraste de la señal fue relativamente bajo (Fig. 4b). En el estado de recuperación (POD21), reapareció la señal en BF (Fig. 4b, derecha). Después de una serie de grabaciones, confirmamos que la región adyacente de BF, donde se detectó la señal en POD7, era Dys en un análisis histológico posterior (Fig. 4c y Fig. 7 complementaria).

un esquema que muestra imágenes de señales intrínsecas durante la estimulación de bigotes por el dispositivo piezoeléctrico. Se utilizó un LED rojo para obtener imágenes de la señal intrínseca y un LED verde para obtener el patrón de los vasos de la superficie del cerebro. b Arriba, esquema del transcurso del tiempo para la ligadura del nervio infraorbitario (ION) con un hilo quirúrgico absorbible. Medio, Ejemplos típicos de las imágenes de señales intrínsecas de un animal. Abajo, imágenes superpuestas de la región de la señal (amarillo) y el patrón del vaso utilizado para la alineación. c Tinción con citocromo c oxidasa de una sección tangencial de S1 L4. FP, pata delantera; HP, pata trasera. d Imágenes promediadas con puntuación z (grupo de ligadura, n = 5; grupo simulado, n = 3). Las áreas punteadas indican BF activado por la estimulación de los bigotes antes de la ligadura. R, rostral; L, laterales; POD, día postoperatorio. Barras de escala, 1 mm.

Para confirmar la actividad neuronal de Dys durante la ligadura y la recuperación, registramos el MUA evocado por estímulos en Dys y BF en POD7 y POD21 en animales individuales (Figuras complementarias 8a, b). Se alteró el equilibrio de actividad entre BF y Dys (Figura complementaria 8a, b). La actividad de Dys fue mayor que en BF en algunos animales durante la ligadura en POD7 (Fig. 8a complementaria); además, la actividad de BF se recuperó en POD21 (Fig. 8b complementaria). Los resultados de imágenes de señales intrínsecas de la suma espacial de la actividad neuronal y los registros electrofisiológicos de la actividad neuronal localizada pueden, por lo tanto, subestimar los cambios en la actividad de Dys. En consecuencia, también contamos las neuronas c-Fos positivas en ratones después de que los ratones habían explorado un entorno enriquecido 40,41 (consulte Métodos, Fig. 9a complementaria). De acuerdo con los resultados de las imágenes de señal intrínseca, el número de neuronas positivas para c-Fos aumentó significativamente en Dys pero disminuyó en BF en POD7. Sin embargo, en POD21, se recuperó la cantidad de neuronas positivas para c-Fos en BF (Fig. 9b, c complementarias). Por lo tanto, la región activada cambió dinámicamente de acuerdo con la extensión de la lesión del nervio periférico, y la actividad neuronal en Dys aumentó en la condición similar al dolor.

Finalmente, examinamos si Dys está involucrado en un comportamiento similar al dolor, como escapar de estímulos dañinos. Para esto, monitoreamos los comportamientos de los animales con la cabeza restringida que se movían libremente en una cinta rodante esférica42 en respuesta a un láser infrarrojo (IR) nocivo o nocivo aplicado a la almohadilla del bigote izquierdo (Fig. 5a). La aplicación del láser IR durante 500 y 1500 ms aumenta la temperatura de la piel a 39 °C y 52 °C, respectivamente43, por lo que nos referiremos como calor nocivo (innH) y noxH, respectivamente. En respuesta a noxH, la velocidad de viaje aumentó hasta 5 s después del inicio del estímulo del láser IR y la dirección de carrera cambió hacia el lado opuesto a la entrada nociva cuando los ratones intentaron escapar de la entrada nociva (Fig. 5b-d y Figura complementaria 10a, Dirección). Los animales también exhibieron parpadeo y tensión en los ojos (Fig. 10a complementaria), que se consideran expresiones de dolor44,45,46. Por lo tanto, este sistema era adecuado para cuantificar comportamientos similares al dolor en respuesta a noxH.

un esquema para monitorear el comportamiento de escape inducido al aplicar un láser infrarrojo (IR) de 808 nm a la almohadilla del bigote izquierdo de un animal que se mueve libremente con la cabeza restringida en una cinta rodante esférica. La dirección y la velocidad del movimiento fueron monitoreadas por una cámara en la parte posterior, y la expresión facial y el movimiento de las extremidades anteriores fueron monitoreados por cámaras laterales. b Ejemplos de velocidad de escape en respuesta a estímulos IR de 500 y 1500 ms, correspondientes a 0,09 (calor nocivo, innH) y 0,27 J/mm2 (noxH), respectivamente. c Perfiles de velocidad promedio con (innH, naranja; noxH, rojo) y sin (negro) estimulación IR (n = 6 ratones). *P < 0,05, **P < 0,01. d Velocidades máximas inducidas por estimulación IR (n = 6 ratones, ns, no significativo; **P = 3,1 × 10−6 (Sin estimulación frente a noxH), 0,0055 (innH frente a nox H); ANOVA unidireccional seguido de prueba de Tukey-Kramer). e Esquema para silenciar seis posiciones S1 (a 430 μm de distancia) a través de la fotoactivación de 473 nm de la canalrodopsina-2 (ChR2) durante la estimulación con noxH. Barra de escala, 1 mm. +, bregma; R, rostral; L, laterales; D, dorso. f Los perfiles de velocidad promedio muestran que la supresión optogenética en P3 (azul) o P4 (cian) redujo significativamente la velocidad de escape a noxH (n = 6 ratones). *P < 0,05. g Puntuaciones z medias de la velocidad máxima (n = 6 ratones). **P = 2,3 × 10−5 (noxH frente a P3), 2,0 × 10−4 (noxH frente a P4); ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Tukey-Kramer. Las barras de sombreado y error indican SEM para ratones.

Usando este sistema, examinamos el efecto de modular la actividad de Dys en el comportamiento similar al dolor. Supervisamos comportamientos similares al dolor inducidos por noxH durante la supresión optogenética de varias áreas corticales, incluida Dys (Fig. 5e). Para este experimento, no evaluamos el parpadeo o el endurecimiento de los ojos, que implican acciones reflejas a través del tronco encefálico y el cerebelo47. Utilizamos una línea transgénica que expresa canalrodopsina-2 (ChR2)-EYFP en interneuronas que expresan parvalbúmina (PV) (PV-Cre × Ai32) y fotoactivamos las interneuronas PV para inhibir las neuronas piramidales corticales localmente48,49,50 (Fig. 5e) . Dado que Dys es una región estrecha (aproximadamente 0,4 mm) adyacente a BF (sección tangencial, Fig. 4c), estimular Dys mientras se excluye BF o la región de la pata es un desafío. Por lo tanto, cambiamos las posiciones de estimulación con láser en seis puntos y luego comparamos los comportamientos48,50. La fotoinhibición en la posición 3 (P3) y P4, que cubría principalmente Dys y parcialmente la región de la pata o BF, disminuyó significativamente la velocidad de escape en respuesta a noxH (1,5 a 2 s en P3 y P4, P < 0,05; y 2 a 2,5 s en P4, n = 6, Fig. 5f). Por el contrario, la fotoinhibición de otras regiones S1, como las regiones BF o de la pata, no tuvo efecto (P> 0.05, Fig. 11 complementaria). Se observaron tendencias similares para la velocidad máxima (P < 0.01 en P3 y P4, no significativo en otras posiciones, Fig. 5g), y para cambios en la dirección y distancia de escape (Fig. 10b complementaria). En resumen, confirmamos que la fotoinhibición en P3 y P4 suprimió el comportamiento de escape de los ratones que corrían en la dirección opuesta a la entrada nociva. En los ratones de control que no expresaron ChR2, la estimulación con láser azul no afectó la velocidad de escape (Fig. 12 complementaria). Estos resultados indican que la supresión local optogenética de las neuronas Dys redujo los comportamientos similares al dolor evocados por noxH.

Para respaldar esta observación, fotoactivamos la fibra talamocortical para activar Dys. Debido a que se cree que las neuronas del núcleo posterior medial (POm) traen información nociceptiva del tálamo a S111, confirmamos la conexión de las neuronas POm con Dys mediante marcadores retrógrados y anterógrados (Fig. 13 complementaria) 16 y utilizamos ratones con el virus inducido. expresión de ChR2 (AAV9-hSyn-ChR2 (H134R) -EYFP) en neuronas POm (Fig. 14a complementaria) 16. Usando estos ratones, observamos que la fotoactivación de Dys en respuesta a innH dio como resultado perfiles de velocidad de la cinta de correr que se asemejan a los de la respuesta a noxH (Fig. 14b complementaria). De manera similar, la velocidad máxima con innH emparejada con la fotoactivación de Dys fue casi la misma que en respuesta a noxH (P = 0.99, Fig. 14c complementaria). Se observaron tendencias similares para la dirección y la distancia de escape (Figura complementaria 14d, e). Estos resultados muestran que la fotoactivación mediada por ChR2 de Dys mejoró los comportamientos similares al dolor. En los ratones de control que carecían de ChR2 en POm, la estimulación con láser azul no tuvo efecto (Fig. 14f-j complementaria). En resumen, los estudios optogenéticos demuestran que la inhibición de Dys reduce los comportamientos similares al dolor, mientras que la activación de Dys los induce en respuesta a innH, lo que revela el papel de Dys en la generación de comportamientos similares al dolor.

Este estudio revela que Dys muestra una alta sensibilidad a las entradas nocivas, mientras que BF prefiere las entradas táctiles. En particular, la información nociceptiva se procesa por separado de la información táctil en Dys L2/3. Dys también responde al dolor neuropático. Reflejando la representación espacialmente distinta de la nocicepción, la supresión optogenética de la actividad Dys redujo los comportamientos dolorosos nocivos provocados por el calor, mientras que la misma manipulación en BF no mostró efectos conductuales. Estos hallazgos indican que Dys está involucrado en la nocicepción y en la generación de comportamientos similares al dolor.

Estudios previos informaron que las neuronas corticales que no responden están ubicadas en las capas más profundas de BF11,22,23 y Dys24, pero las diferencias funcionales entre las dos subregiones siguen siendo desconocidas. Aquí, demostramos que Dys y BF tienen roles separados en el procesamiento nociceptivo y táctil, especialmente en L2/3. Nuestros datos neurofisiológicos muestran además que la entrada de noxH suprime la actividad neuronal en BF L2/3. Esta supresión puede ser la base neural para alterar la agudeza de la sensación táctil durante el dolor30,31.

En contraste con L2/3, la segregación del procesamiento de información nociceptiva y táctil fue menos clara en L5b, con mayores proporciones de neuronas integradoras en ambas regiones. Sin embargo, se mantuvo la preferencia por los estímulos táctiles en las neuronas L5 BF; Las neuronas BF mostraron una mayor preferencia por la entrada táctil que las neuronas Dys (Fig. 2c). Debido a que se sugiere que las neuronas L5 modulen las entradas nociceptivas a través de la vía corticofugal14,15, las neuronas BF L5 podrían relacionarse con el alivio del dolor inducido por el tacto en condiciones normales51, mientras que las neuronas Dys L5 podrían contribuir a la alodinia mecánica (Fig. 4).

El hallazgo notable en el presente estudio es que Dys, pero no BF, está involucrado en la generación del comportamiento de escape (Fig. 5). Para un comportamiento de escape apropiado, el animal necesita correr en una dirección alejada de la entrada nociva (Fig. 5d y Fig. 10a complementaria). La inactivación de Dys por la activación optogenética de las interneuronas PV locales redujo la velocidad de escape y interrumpió la selectividad direccional para escapar de entradas nocivas (Fig. 5g y Fig. 10b complementaria). Varias líneas de evidencia anatómica sugieren que Dys está íntimamente relacionado con la función motora y el procesamiento del dolor. Dys, por ejemplo, recibe información propioceptiva a través de POm16,20,21 y se proyecta a la corteza motora primaria27. Dys también se proyecta a la corteza cingulada anterior27, que integra el dolor sensorial y afectivo y modula el comportamiento similar al dolor12,13. Además, Dys tiene una conexión neuronal con la corteza somatosensorial secundaria27, que está involucrada en el procesamiento de la información nociceptiva52,53. Por lo tanto, es probable que las redes neuronales mediadas por Dys promuevan un comportamiento de escape apropiado al integrar el procesamiento de propiocepción y nocicepción.

La fotoactivación de las fibras talamocorticales que se proyectan desde POm a Dys indujo un comportamiento de escape (Fig. 14 complementaria), lo que confirma los hallazgos de la inhibición optogenética de Dys (Fig. 5). Dado que las neuronas en POm se proyectan a Dys L4 y BF L516,54,55 (Fig. 13b complementaria), puede que no sea posible excluir por completo la contribución de BF. La activación de BF reduce el comportamiento similar al dolor a través de la inhibición directa de los axones corticotrigéminos de L514. Además, las proyecciones descendentes de Dys terminan en áreas distintas de las de las regiones cutáneas S1, como BF56. Teniendo en cuenta estos informes, en el estudio actual, la fotoactivación de las fibras POm-S1 que inducen el comportamiento del dolor es una consecuencia de la activación de las fibras POm-Dys. Estos hallazgos sugieren que Dys y BF producen diferentes efectos en las conductas de escape y similares al dolor.

Se ha sugerido que el control de la actividad S1 modula los umbrales del dolor14,33. Dado que la manipulación de la actividad de Dys controla el comportamiento similar al dolor (Fig. 5), la inhibición selectiva de la región que no responde en S1 puede ser un objetivo terapéutico en el manejo del dolor clínico sin afectar otras funciones de S1. Las lesiones corticales cerebrales en S1 provocan un alivio permanente del dolor (revisado en Whitsel et al57). Las neuronas en el área 3a de primates no humanos, una región disgranular basada en su citoarquitectura57, responden a estímulos nocivos8,57,58 y propioceptivos59. Estas observaciones y relaciones filogenéticas60 sugieren que el área 3a de los primates es un homólogo evolutivo del roedor Dys. Además, el área humana 3a puede desempeñar un papel central en la percepción del dolor61. Por lo tanto, el área humana 3a puede ser uno de los objetivos ideales de intervención para el alivio del dolor. Sin embargo, el área 3a está enterrada en el fondo del surco central en humanos62. Por lo tanto, la intervención selectiva del área 3a es un desafío y debe resolverse para el tratamiento efectivo del dolor crónico en el futuro57,58. Sin embargo, nuestros resultados sugieren fuertemente que la región nociceptiva distintiva en S1 es un objetivo terapéutico potencial para el alivio del dolor.

Todos los procedimientos quirúrgicos y el cuidado postoperatorio se realizaron de acuerdo con las pautas del Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad Médica de Mujeres de Tokio. Todos los experimentos con animales fueron aprobados con el número AE19-109. C57BL/6 N (Sankyo Lab. Service Corp., Tokio, Japón), PV-Cre (N.° de inventario de JAX 008069) y Ai32 (Rosa-CAG-LSL-ChR2[H134R]-EYFP-WPRE; N.° de inventario de JAX 012569) En este estudio se usaron líneas de ratón. Los ratones PV-Cre se cruzaron con ratones Ai32 y la línea de ratones resultante se denominó PV-ChR2. Se usaron ratones macho de 8 semanas o más de edad. Los animales se alojaron en grupo en una jaula mantenida a 23 °C ± 1 °C, 50 ± 15 % de humedad con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y todas las pruebas de comportamiento se realizaron durante el período de oscuridad. Se hizo todo lo posible para minimizar el número de ratones utilizados y su sufrimiento en este estudio. Para los procedimientos quirúrgicos, cada animal fue anestesiado con una inyección intraperitoneal de ketamina (100 mg/kg de peso corporal) y xilazina (16 mg/kg de peso corporal), y se complementó con isoflurano para mantener la anestesia. Se aplicó lidocaína por vía subcutánea en el sitio de la incisión y en los márgenes de la herida para anestesia tópica. Para obtener imágenes ópticas de señales intrínsecas, registros electrofisiológicos y pruebas de comportamiento en una cinta rodante esférica, se adjuntó al cráneo una placa de cabeza hecha a la medida con resina acrílica transparente dental (Super-Bond; Sun Medical, Shiga, Japón). Los animales a los que se les implantó la placa de cabeza se devolvieron a la jaula de origen y se les permitió recuperarse de la cirugía durante al menos 4 días.

Para los registros electrofisiológicos de Dys y BF, cada ratón fue anestesiado con isoflurano (0,4-0,8 %) complementado con una inyección intraperitoneal de clorhidrato de clorprotixeno (2 mg/kg de peso corporal)63. Dado que la respuesta nociceptiva depende del nivel de anestesia64, se monitorizó la frecuencia respiratoria (70-120 ciclos/s) para controlar el nivel de anestesia.

Primero identificamos el borde entre Dys y BF según la imagen de señal intrínseca mediante estimulación de bigotes (consulte "Imágenes ópticas de señal intrínseca"). Luego, se insertaron electrodos de cuatro vástagos de 32 canales (A4x8 o Buzsaki32; NeuroNexus, Ann Arbor, MI, EE. UU.) Teñidos con DiI (V22885, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en Dys y BF. Registramos simultáneamente la actividad neuronal de cada región con los campos receptivos de los bigotes de la fila E. Para registrar las neuronas con campos receptivos que cubren los bigotes de la fila E y la almohadilla de los bigotes alrededor de la fila E65, se colocaron al menos dos vástagos en el barril de la fila E y Dys adyacentes al barril de la fila E (Fig. 1a).

Las señales eléctricas sin procesar se amplificaron y digitalizaron a 40 kHz (Plexon, Dallas, TX, EE. UU.) y luego se procesaron para la clasificación de picos. La clasificación de picos comprendía la detección automática de picos y el agrupamiento mediante Klusta (ver. 3.0.16) seguida de una clasificación manual mediante la GUI de Kwik (v1.0.9)66. En primer lugar, se extrajeron los artefactos de ruido determinados a partir de la forma de onda. En segundo lugar, se determinó la actividad multiunitaria (MUA) a partir de la forma de onda con baja amplitud y sin período refractario (>2 ms) en los autocorrelogramas. En tercer lugar, después de fusionar y/o dividir los grupos utilizando correlogramas automáticos y cruzados y características de los componentes principales, la actividad de una sola unidad (SUA), que tiene un período refractario claro (> 2 ms) en los correlogramas automáticos, o MUA fue determinado. Para estimar la profundidad de las neuronas registradas, se compararon y determinaron las amplitudes máximas de las formas de onda de cada sonda para la sonda más cercana de cada SUA/MUA. Para el análisis MUA, se incluyó SUA (n = 8 animales, 128 sitios de sonda registrados simultáneamente para el análisis MUA).

Para el análisis de datos electrofisiológicos del cepillado en la almohadilla del bigote izquierdo (Fig. 2 complementaria), la estimulación de von Frey (Fig. 5 complementaria) y la estimulación durante la ligadura ION (Fig. 8 complementaria), las señales eléctricas sin procesar se amplificaron y digitalizaron a 30 kHz (Open Ephys67, Open Ephys GUI, v0.5.0) y luego se procesa para la clasificación de picos. La clasificación de picos comprendía la detección automática de picos y la agrupación mediante Kilosort (v2.0, https://github.com/cortex-lab/KiloSort) seguido de la clasificación manual mediante Phy (v2.0b1, https://phy.readthedocs.io/ es/último/). Para el análisis MUA en POD7 y POD21 (Fig. 8 complementaria), usamos el mismo electrodo de 32 canales y 4 vástagos (Buzsaki32) en cada grabación. Luego seleccionamos los dos vástagos vecinos en Dys y BF y comparamos el número total de picos registrados en cada vástago.

Después de los registros, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico (60 mg/kg de peso corporal, por vía intraperitoneal) y se perfundieron transcardiacamente con una solución fijadora (paraformaldehído al 4 % y ácido pícrico al 0,2 % en tampón fosfato 0,1 M). Se extrajeron los cerebros y se cortaron coronalmente en secciones de 50 µm. Las secciones se incubaron durante la noche con un anticuerpo policlonal de cobaya contra VGluT2 (cobaya; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japón) seguido de NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) para identificar los sitios de grabación. Las imágenes se capturaron con un microscopio vertical (AxioScope.A1, Zeiss, Alemania) con una cámara CCD refrigerada (RS 6.1 s, QSI, Cambridge, Inglaterra) con µManager (ver. 1.4, https://micro-manager.org/ ).

Calculamos la S/N para identificar el área o las propiedades de las células y evaluamos la selectividad al calor nocivo y los estímulos táctiles. Se colocó un dispositivo Peltier (4,2 mm × 4,0 mm) en la almohadilla del bigote izquierdo para aplicar el estímulo de calor. Para asegurar la transferencia de calor a la piel, se eliminó el vello entre los bigotes con espuma depilatoria, dejando los bigotes intactos. Para la S/N de la respuesta al calor nocivo, la respuesta durante 500 ms a 45–50 °C para el dispositivo Peltier (sombreado beige, Fig. 1e) se contó como la respuesta S. La respuesta de calor inocuo (durante 1000 ms hasta 45 °C, correspondiente a 33–45 °C, sombreado gris, Fig. 1e) se contó como la respuesta de N. Esta definición ayudó a seleccionar neuronas selectivas de calor nocivas al excluir las neuronas codificadoras de temperatura.

Para los estímulos táctiles, la respuesta durante 30 ms después del inicio de la desviación del bigote (flechas azules, Fig. 2a, derecha) se contó como la respuesta S. La respuesta durante 60 ms hasta el inicio de la desviación del bigote se contó como la respuesta N (Fig. 2a). Todas las deflexiones se utilizaron para este cálculo (Fig. 2b). Esta definición ayudó a detectar cómo responde la neurona a la deflexión secuencial de los bigotes68.

Se aplicó un filamento de von Frey (10 g) a la almohadilla del bigote izquierdo como estímulo para el dolor mecánico. Se eliminaron todos los bigotes y los pelos diminutos entre los bigotes en la almohadilla del bigote izquierdo para detectar la aplicación del filamento de von Frey de 10 g a la piel. Todos los ensayos de estimulación fueron monitoreados por una cámara de alta velocidad que grababa a 200 Hz (XiQ, Ximea GmbH, Münster, Alemania). La región de interés se colocó en la almohadilla del bigote y se calculó la curvatura de la piel (gráficos de color en la Fig. 5a complementaria). Un punto de saturación de la flexión de la piel identificó el inicio de la flexión del filamento de von Frey.

Se disolvió capsaicina (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japón) en etanol al 100 % y Tween 80 al 7 % en solución salina (10 mM). Como vehículo se utilizó una solución que contenía etanol al 100 %, Tween 80 al 7 % y solución salina69. Los animales se trasladaron a sus jaulas de origen desde las instalaciones para animales y se anestesiaron con isoflurano al 2%. Después de la inyección de capsaicina (50 μL) o vehículo (50 μL) en la almohadilla del bigote izquierdo, los ratones se colocaron nuevamente en sus jaulas y se devolvieron a las instalaciones para animales.

Tres horas después de la inyección, los ratones se anestesiaron profundamente con isoflurano (2-3 %, 5 min) y se perfundieron transcardiacamente con una solución prefijadora (sacarosa 250 mM y MgCl2 5 mM en solución salina tamponada con fosfato 0,02 M, pH 7,4) que contenía heparina sódica. sal (30 a 40 unidades/ml) seguida de una solución fijadora (paraformaldehído al 4% y ácido pícrico al 0,2% en solución tamponada con fosfato 0,1 M). Los cerebros se posfijaron a 4 °C durante 12 a 16 h en fijador fresco y se cortaron coronalmente en secciones de 40 μm de espesor con un vibratomo (VT1000S, Leica Microsystems Inc, Wetzlar, Alemania). Las secciones se incubaron a 20–25 °C durante 12–16 h con una mezcla de anticuerpo policlonal de conejo contra c-Fos (1:2000; 226 003, Synaptic Systems GmbH, Göttingen, Alemania), un anticuerpo policlonal de cobayo contra VGluT2 ( 1:500; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japón), un anticuerpo policlonal de cabra contra calbindina D-28K (1:500; MSFR100410, Nittobo Medical Co., Ltd.) y un anticuerpo monoclonal de ratón contra NeuN (1:500; MAB377, Merck, Darmstadt, Alemania) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,05 M que contiene un 10 % de suero de burro normal y un 0,3 % de Triton X-100. Después de lavar 2 o 3 veces con PBS, las secciones se incubaron más a 20–25 °C durante 2–3 h con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor Plus 555 (para c-Fos, 1:500; A32794, Thermo Fisher Scientific, Waltham , MA, EE. UU.), Alexa Fluor 647 (para VGluT2, 1:500; 706-605-148, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, EE. UU.), Alexa Fluor 488 (para calbindina, 1:500; A11055, Thermo Fisher Scientific ) y Alexa Fluor Plus 405 (para NeuN, 1:500; A48257, Thermo Fisher Scientific) en PBS 0,05 M que contiene un 10 % de suero de burro normal y un 0,3 % de Triton X-100. Después de lavar 2 o 3 veces con tampón de fosfato 0,1 M, las secciones se montaron en portaobjetos de vidrio, se sellaron con medio de montaje antidecoloración SlowFade Diamond (Thermo Fisher Scientific) y se cubrieron con cubreobjetos. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio de fluorescencia (BZ-X 810, Keyence, Tokio, Japón). El número de células que expresan c-Fos en cada columna de BF y Dys se contó manualmente. También se contó el número de neuronas teñidas con NeuN en las mismas regiones de interés. El conteo manual fue realizado por un observador independiente cegado.

Después de posfijar los cerebros, se hicieron cortes de 50 μm de espesor y cortes alternos se hicieron reaccionar con citocromo c oxidasa para identificar BF y con inmunohistoquímica de c-Fos. Para la inmunohistoquímica de c-Fos, los cortes se procesaron con H2O2 al 1 % en tampón de fosfato para desactivar la peroxidasa intrínseca y luego se incubaron con anticuerpo anti-c-Fos (1:10000, conejo; Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) en un ambiente normal al 10 %. suero de cabra en solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100 al 0,3 % a 4 °C durante la noche. A continuación, los cortes se incubaron con anticuerpo IgG anti-conejo de cabra biotinilado (1:200; Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE. UU.) y se hicieron reaccionar con complejo avidina-biotina-peroxidasa (kit ABC; Vector Laboratories). Los cortes se incubaron en solución de DAB (0,02 % de DAB, 0,3 % de sulfato de níquel y amonio en solución salina tamponada con Tris) y H2O2 al 1 % para su visualización. Las imágenes se adquirieron con un microscopio vertical con una cámara CCD (DP70; Olympus, Tokio, Japón) usando Olympus DP Manager (ver. 3.1.1.208, Olympus). Las neuronas que expresaban c-Fos se contaron utilizando un programa MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) escrito a medida (Software complementario 1) con detección de bordes mediante un filtro Sobel seguido de binarización. Un observador independiente cegado contó manualmente el número de células que expresaban c-Fos en tres cortes; este individuo no participó en el conteo automático y confirmó que la tendencia de la expresión de c-Fos en cada capa no difería entre las regiones.

Para el marcaje retrógrado, se aplicó la subunidad B de la toxina del cólera conjugada con Alexa Fluor 555 (0,2 %) o Alexa Fluor 488 (1 %) después de la obtención de imágenes de señal intrínseca para identificar Dys y BF, respectivamente. Tres días después, los ratones se anestesiaron profundamente con pentobarbital sódico (60 mg/kg de peso corporal, por vía intraperitoneal) y se perfundieron transcardiacamente con una solución fijadora (paraformaldehído al 4 % y ácido pícrico al 0,2 % en tampón fosfato 0,1 M). Se extrajeron los cerebros y se cortaron coronalmente en secciones de 50 µm. Las secciones se incubaron durante la noche con un anticuerpo policlonal de cobaya contra VGluT2 (1:500; MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japón) seguido de NeuroTrace 435/455 (1:100; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. EE.UU).

Para el marcaje anterógrado, se inyectó dextrano amina biotinilada (peso molecular: 10 000, 10 % en solución salina; Thermo Fisher Scientific) en el POm (1,7 mm posterior al bregma y 1,3 mm lateral a la línea media). Siete días más tarde, los ratones se anestesiaron profundamente y las secciones del cerebro se cortaron como se describe anteriormente. Las secciones se incubaron durante la noche con anticuerpo VGluT2 (cobaya; 1:500, MSFR106290, Nittobo Medical Co., Ltd., Tokio, Japón) seguido de anticuerpo anti-cobaya conjugado con Alexa Fluor 594 (1:500; 706-585- 148, Jackson ImmunoResearch), estreptavidina conjugada con Alexa Fluor 488 (1:500; S11223, Thermo Fisher Scientific), y posteriormente con NeuroTrace 435/455 (1:100; S21479, Thermo Fisher Scientific).

Al menos 4 días después de la implantación de la placa de cabeza, se realizaron imágenes de señal intrínseca para medir las respuestas de BF. El ratón fue anestesiado como se describe anteriormente en "Registro electrofisiológico". La frecuencia respiratoria y la frecuencia cardíaca se monitorearon a través de un monitor de respiración basado en video con una cámara web de 30 Hz (C920; Logitech, Lausanne, Suiza) y un monitor de aceleración hecho a medida en la parte posterior del animal. Las imágenes de señales intrínsecas se obtuvieron usando el software microDisplay (ver. 5.2.3.1, Silicon Software GmbH, Alemania) por una cámara CMOS (MV1-D1024E-160-CL; Photonfocus, Lachen, Suiza) con la lente tándem de un doblete acromático (Thorlabs , Newton, NJ, EE. UU.) y filtros de paso largo y paso corto (BLP01-488R-25 y FF01-650/SP-25; Semrock, Rochester, NY, EE. UU.). Los cuadros se adquirieron a una velocidad de 20 Hz, y el tamaño del cuadro fue de 600 × 500 píxeles y representó 5,5 × 4,5 mm del área cortical. La superficie del cerebro se iluminó con un LED verde (M530L3; Thorlabs) para obtener el patrón del vaso o con un LED rojo (M617L3; Thorlabs) para obtener la señal intrínseca. La luminancia del LED rojo fue constante entre cada imagen. Se controló la frecuencia respiratoria (70–120 ciclos/s) para realizar un seguimiento de la profundidad de la anestesia. Las imágenes se registraron a través del cráneo cubierto con resina acrílica transparente dental. La resina acrílica dental se cubrió con una capa superior para uñas y aceite de inmersión de silicona (Olympus) para reducir el deslumbramiento.

Se generaron estimulaciones de bigotes como estímulos táctiles usando un dispositivo piezoeléctrico como se describió anteriormente68. Para visualizar la respuesta cortical a los estímulos táctiles, calculamos la relación de reflectancia en cada cuadro (dR/R, donde dR es la diferencia de reflectancia R de la imagen base que es el promedio de 20 cuadros tomados antes del inicio del estímulo). Para mapear el cambio en la actividad cortical, las imágenes tomadas en diferentes días experimentales se alinearon de acuerdo con los patrones de los vasos utilizando un programa MATLAB personalizado. Para el análisis de población, calculamos la imagen con puntaje z de dR/R usando la siguiente ecuación:

donde SD es la desviación estándar. Las posiciones de la bregma se utilizaron para el alineamiento entre animales.

Para producir un modelo de dolor neuropático, el ION se ligó firmemente con un hilo quirúrgico (Vicryl Rapide; Ethicon, Bridgewater, NJ, EE. UU.). Este hilo nos permite observar cambios en la actividad de BF durante la lesión nerviosa y la recuperación, ya que la resistencia a la tracción del hilo se reduce gradualmente dentro del cuerpo (dentro de 2 a 3 semanas); la resistencia a la tracción se reduce a casi un 50% en POD7 y 0% en POD21, correspondientes a las fases de lesión nerviosa y recuperación, respectivamente. Para el ensayo conductual del dolor neuropático, se entrenó a los animales para que entraran en un tubo de 50 ml con un soporte de tubo hecho a medida. El entrenamiento conductual comenzó después de que los ratones tuvieran acceso restringido al agua (1 ml/día) al menos 7 días antes de la ligadura de ION izquierda o la operación simulada. El agua se restringió a 1,5 ml durante 1 día durante el experimento de comportamiento. Los animales fueron entrenados para entrar en el tubo y mantener sus hocicos sobresaliendo por un agujero para beber el agua. Mientras los animales bebían, la almohadilla del bigote izquierdo fue estimulada por los filamentos de von Frey (1,4, 2, 4, 6, 8 y 10 g; Ugo Basile, Varese, Italia) para medir el umbral de escape70. Durante la estimulación, la información visual fue bloqueada por una cubierta negra (Fig. 6 complementaria).

A los 7 o 21 días después de la ligadura de ION y 7 días después de la operación simulada, los ratones se colocaron en un entorno enriquecido durante 1 hora para aumentar el batido mientras exploraban varios objetos (Fig. 9 complementaria) 40,41. Luego, los ratones se perfundieron con paraformaldehído al 4% con ácido pícrico seguido de inmunohistoquímica c-Fos usando el protocolo DAB descrito anteriormente.

Los ratones primero fueron entrenados para entrar en un tubo para obtener una recompensa de agua durante 3 a 4 días. Luego, a los ratones se les fijó la cabeza y se los dejó correr en una cinta rodante esférica (Ø 30 cm) bajo ruido blanco71 durante 3 o 4 días. Después de esto, se monitorearon los comportamientos de los ratones hacia el estímulo del láser IR en la almohadilla del bigote izquierdo. Para el estímulo de calor nocivo, un láser de diodo IR (Ø 1 mm en la almohadilla del bigote, longitud de onda de 808 nm, SSL-808-1000-10TM-D-LED; Shanghai Sanctity Laser Technology Co., Ltd., Shanghai, China) se utilizó. La duración del estímulo se fijó en 500 o 1.500 ms, correspondientes a 0,09 y 0,27 J/mm2, respectivamente, para aumentar la temperatura de la piel a 39 °C o 52 °C43. Al inicio y al final de cada sesión, los animales obtuvieron una recompensa de agua en la cinta rodante pero no durante las sesiones de estímulo. Cada sesión se compuso de varias condiciones de estímulo, y cada condición se eligió al azar y se presentó al animal cinco veces en una sesión. Se tomaron imágenes de los animales con tres cámaras a 30 Hz (se quitó el filtro IR del sensor CMOS; C922, Logitech, Lausanne, Suiza) colocadas detrás y a cada lado del animal para registrar comportamientos como dirección de escape, velocidad, distancia de movimiento , parpadeo y movimiento de la extremidad anterior izquierda. Estos parámetros se analizaron calculando la diferencia de la región de interés de cada parámetro cuadro por cuadro. Estos parámetros se calcularon en puntuaciones z para comparaciones entre los animales mediante un código MATLAB personalizado (Software complementario 2). Si el animal corría continuamente en la cinta rodante antes del inicio del estímulo, el efecto del estímulo estaba enmascarado. Estos animales tendían a correr continuamente independientemente de los estímulos. Por lo tanto, no se pudo observar ninguna diferencia en la velocidad máxima entre las pruebas y estas sesiones se excluyeron del análisis. Se utilizaron al menos dos sesiones para calcular las puntuaciones z. Se colocó un filtro de muesca (filtro de muesca OD4 de 808 nm, 86-702; Edmund Optics) frente a la cámara del lado izquierdo para evitar el desvanecimiento del sensor y para identificar la posición y el tamaño precisos de la estimulación del láser IR. Se colocaron iluminadores LED hechos a la medida (940 nm) frente a cada cámara para iluminar a los animales.

Para activar las fibras talamocorticales de POm a Dys, se inyectó un virus (AAV9-hSyn-hChR2(H134R)-EYFP) en el POm derecho (1,7–1,9 mm caudal y 1,2 mm lateral a bregma; profundidad, 2800 y 3000 μm desde la superficie del cerebro; 50 nL en cada profundidad) (QSI; Stoelting, Wood Dale, IL, EE. UU.). Se acopló un láser azul (473 nm; Lasos, Alemania) a un cable de fibra óptica (Ø 200 μm; Thorlabs). La salida de la fibra óptica y la superficie de la corteza se colocaron en planos conjugados utilizando un puerto de fibra y una lente acromática. Los espejos x e y Galvano (sistema de exploración Galvano, GVS002; Thorlabs) se colocaron en el espacio infinito para controlar la posición del estímulo. También se colocó un espejo dicroico en el espacio infinito y la luz reflejada se enfocó en el sensor de una cámara CMOS (Grasshopper3; Teledyne FLIR, Oregón). Este diseño permitió monitorear la ubicación precisa del sitio estimulado49.

Se utilizó un interruptor óptico (ancho de pulso, 2,5 ms, MC2000B; Thorlabs) para activar las interneuronas PV con un pulso de 40 Hz72. Para investigar el efecto supresor de la actividad de Dys, las seis posiciones que cubren Dys fueron estimuladas por un láser de 473 nm enfocado en la superficie del cerebro por una lente doble acromática (AC254-60-A; Thorlabs). Los centros de los sitios de estimulación estaban separados por 430 µm. La potencia fue de 0,9 mW por ubicación y el radio de 0,5 a 0,75 mm, lo que resultó en 0,51 a 1,15 mW/mm2, con atenuación de la luz a través del cráneo50. Las posiciones del láser en ambos extremos, la posición 1 (P1) y P6, estaban bien separadas de Dys, mientras que P3 y P4 estaban centrados en Dys. Dado el tamaño del punto de luz, P3 y P4 pueden estimular parcialmente la pata vecina y las regiones BF.

Las estadísticas se realizaron utilizando MATLAB (R2018a, 9.4.0.813654). Los datos se presentan como media ± SEM, a menos que se indique lo contrario. Las secciones coronales representativas que se muestran en la Fig. 1a, las Figs. complementarias. 1b, 9b, 13a, b y 14a, y las secciones tangenciales representativas que se muestran en la Fig. 4c y la Fig. 7 complementaria se repitieron de forma independiente con resultados similares al menos tres veces o con el mismo número de animales que se muestran en cada experimento.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan los hallazgos de este estudio se proporcionan en el documento y su información complementaria. Con este documento se proporciona un archivo de datos de origen. Todos los datos están disponibles a los autores previa solicitud. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Todos los códigos de computadora utilizados para analizar o mostrar los datos están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos a Sachie Sekino y Yumi Tani por su excelente asistencia técnica. Esta investigación fue financiada por los números de subvención JSPS KAKENHI JP15K21387, JP17H05912, JP18K14854, JP21K07285 y Uehara Memorial Foundation to HO 752, JP15H01667, y el Fondo de Becas SHISEIKAI para Investigador Básico de Ciencias Médicas, Premio Keiko Watanabe a MM y JSPS KAKENHI números de subvención JP21K06444 a YU y el programa de Mapeo Cerebral por Neurotecnologías Integradas para Estudios de Enfermedades (Brain/MINDS) de la Agencia de Investigación y Desarrollo Médico de Japón, AMED, bajo subvención número JP19dm0207057.

Hironobu Osaki

Dirección actual: Laboratorio de Construcción de Circuitos Cerebrales Funcionales, Escuela de Graduados en Ciencias del Cerebro, Universidad Doshisha, Kyotanabe, Kioto, Japón

División de Neurofisiología, Departamento de Fisiología, Escuela de Graduados en Medicina, Universidad Médica Femenina de Tokio, Shinjuku, Tokio, Japón

Hironobu Osaki, Moeko Kanaya, Yoshifumi Ueta y Mariko Miyata

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HO y MM diseñaron los experimentos. HO, MK y YU realizaron los experimentos y analizaron los datos. HO y MM escribieron el borrador original.

Correspondencia a Hironobu Osaki o Mariko Miyata.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Jochen Staiger, Oleg Favorov y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de revisión por pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

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Osaki, H., Kanaya, M., Ueta, Y. et al. Procesamiento de nocicepción distinto en las regiones disgranulares y de barril de la corteza somatosensorial del ratón. Nat Comun 13, 3622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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Recibido: 25 de marzo de 2021

Aceptado: 07 junio 2022

Publicado: 29 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31272-w

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