Hacia un citófono portátil arcoíris con diodos láser para el diagnóstico global de enfermedades

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 8671 (2022) Citar este artículo

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In vivo, Cytophone ha demostrado la capacidad para el diagnóstico temprano de cáncer, infecciones y trastornos cardiovasculares a través de la detección fotoacústica de marcadores de enfermedades circulantes directamente en el torrente sanguíneo con una mejora sin precedentes de 1000 veces en la sensibilidad. Sin embargo, se necesita con urgencia un citófono con mayor especificidad y portabilidad. Aquí presentamos una nueva plataforma de citófonos que integra una matriz de diodos láser multiespectrales en miniatura, codificación de tiempo y color y procesamiento de señal de resolución temporal de alta velocidad. Usando diodos láser de dos colores (808 nm/915 nm), demostramos la identificación espectral de coágulos blancos y rojos, células de melanoma y hemozoína en eritrocitos infectados con malaria contra un fondo de sangre y artefactos. Los datos de un modelo murino de Plasmodium yoelii y P. falciparum humano cultivado se verificaron in vitro con microscopía fototérmica y fluorescente confocal. Con estas técnicas, detectamos células infectadas dentro de las 4 horas posteriores a la invasión, lo que hace que la hemozoína sea prometedora como marcador espectralmente selectivo en las primeras etapas de la progresión de la malaria. Junto con los hallazgos de nuestra aplicación anterior de Cytophone con láseres convencionales para el diagnóstico de melanoma, bacteriemia, anemia falciforme, trombosis, accidente cerebrovascular y formas anormales de hemoglobina, este hallazgo actual sugiere el potencial para el desarrollo de un Cytophone arcoíris portátil con láser multiespectral. diodos para la identificación de estas y otras enfermedades.

Se ha logrado un progreso significativo en el diagnóstico de enfermedades utilizando láseres avanzados1. Entre los diferentes métodos láser, las técnicas fotoacústicas (PA) han mostrado ventajas en cuanto a sensibilidad, no invasividad y profundidad de penetración en biotejidos de hasta 3 a 5 cm2,3,4. Varios dispositivos de diagnóstico por imágenes de PA han demostrado resultados clínicos prometedores in vivo en humanos, incluida la evaluación del estado de la enfermedad de Crohn5, el diagnóstico de cáncer de mama6,7 y el control de la oxigenación de la sangre en las venas yugulares8. El diagnóstico de estas y muchas otras condiciones médicas a menudo comienza con el examen de sangre de un paciente; sin embargo, los análisis de sangre existentes no pueden proporcionar un diagnóstico temprano porque su sensibilidad está limitada por el pequeño volumen de sangre recolectado (típicamente de 5 a 10 mL para muestras venosas y unos pocos μL para muestras capilares), que no detecta hasta 103 a 104 de las células anormales. o biomarcadores en el volumen total de sangre (~ 5 L en adultos)9. Esta gran porción de células perdidas puede resultar en una progresión de la enfermedad que es demasiado difícil de tratar, como metástasis, sepsis o accidente cerebrovascular formado por células tumorales circulantes (CTC), bacterias y coágulos, respectivamente9,10. En particular, a pesar de los enormes esfuerzos en el desarrollo de diversos ensayos de CTC, aún no se recomiendan para uso clínico debido a su baja sensibilidad, datos inconsistentes y, como resultado, tienen un valor diagnóstico poco claro, especialmente para el diagnóstico temprano de enfermedades10,11. Además, la mayoría de las técnicas de PA existentes, especialmente las imágenes de PA, no pueden detectar biomarcadores de enfermedades circulantes de movimiento rápido con velocidades típicas de 5 a 10 cm/s, incluso si están presentes en los vasos subcutáneos, lo que limita aún más su utilidad10.

Estas restricciones se pueden resolver mediante la evaluación de volúmenes de sangre más grandes in vivo, utilizando el principio de citometría de flujo in vivo con métodos de detección fluorescente, fototérmico (PT), Raman y especialmente PA y sus combinaciones11,12,13. Entre estos métodos, la citometría de flujo PA in vivo (PAFC) ha demostrado relevancia clínica para la detección directa en el torrente sanguíneo de bacterias (p. ej., S. aureus y E. coli), coágulos, células falciformes, exosomas, diferentes formas de hemoglobina (Hb ) (p. ej., oxi-, desoxi- y meta-Hb), nanopartículas (NP) y CTC que usan PA intrínseco (p. ej., melanina, Hb, Hz [hemozoína], citocromos, carotenoides) o artificial (p. ej., NP de oro) agentes de contraste9,12,14,15,16,17,18,19,20. En un ensayo clínico, PAFC ofreció una mejora de sensibilidad sin precedentes de ~ 1000 veces en comparación con los métodos de diagnóstico existentes para detectar CTC, coágulos y émbolos de coágulos de CTC en pacientes con melanoma in vivo21. También demostramos que PAFC in vivo tiene el potencial para detectar células infectadas con malaria murina circulantes en un modelo animal a un nivel de parasitemia del 0,0000001 %14,15.

Sin embargo, el uso de PAFC en países con recursos limitados está limitado por la complejidad técnica, el gran tamaño y el alto costo de los láseres de pulso de estado sólido comúnmente utilizados (p. basado)1,12. Estas limitaciones también dificultan enormemente el uso de una matriz de láseres con diferentes longitudes de onda, lo que ayudaría en la identificación espectral de biomarcadores con diferentes espectros de absorción, también llamados huellas dactilares espectrales, en particular, para NP, Hb y Hz22,23,24 ,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Específicamente, después de nuestra primera aplicación pionera de diodos láser sintonizables espectralmente en espectroscopia PA34, se realizaron algunos intentos para usar diodos láser para imágenes PA35,36; sin embargo, la energía del pulso de los diodos láser era demasiado baja (al nivel de unos pocos microjulios [µJ]) para proporcionar suficiente sensibilidad. La duración del pulso también fue relativamente larga (90-120 ns) en comparación con el tiempo de tránsito acústico a través del objetivo pequeño para igualar el confinamiento acústico para la generación de señales PA de alta eficiencia14,15. Recientemente, se ha logrado un progreso significativo en el desarrollo de diodos láser más potentes con un ancho de pulso de 15 a 30 ns y una energía de pulso de 0,1 a 2 mJ utilizando tamaños de matriz de emisores de 0,1 × 5 mm2 a 40 × 50 mm37. Sin embargo, se ha avanzado poco en el uso de estos láseres con PAFC. El objetivo del trabajo descrito aquí es llenar el vacío en este campo de investigación mediante el uso de una innovadora plataforma de citófonos de arco iris (es decir, multicolor) basada en PAFC que integra una matriz de diodos láser en miniatura con modulación de luz espectral en el tiempo, resolución en el tiempo. detección de señales PA codificadas por color en el tiempo de cada célula o biomarcador de movimiento rápido, y procesamiento de señales de alta velocidad. En comparación con las fuentes láser convencionales, las ventajas de los nuevos diodos láser incluyen su tamaño pequeño, el uso de conjuntos de emisores compactos con microóptica, bajo costo, alta tasa de repetición, energía láser necesaria y duración de pulso apropiada.

Para ilustrar el rendimiento único de nuestro citófono arcoíris con diodos láser, demostramos que nuestra novedosa plataforma tiene la capacidad de identificar los espectros únicos de múltiples objetos circulantes, incluidos coágulos blancos y rojos, imitar células de melanoma y Hz solos y en pacientes infectados con malaria. glóbulos rojos (RBC) entre el fondo de sangre y otros artefactos. Sobre la base de nuestros estudios previos relacionados con la malaria con láseres de estado sólido14,15, ahora exploramos el potencial de los diodos láser como nuevas fuentes ópticas prometedoras para permitir una mayor especificidad de PAFC. Este trabajo nos obligó a superar desafíos tales como baja energía de pulso, alta divergencia de radiación (especialmente con conjuntos de diodos láser) y detección y filtración de alta velocidad de señales PA multicolores generadas en células individuales infectadas de rápido movimiento mediante pulsos de diodos láser con diferentes longitudes de onda. . Enfocamos particularmente nuestra novedosa plataforma en la malaria, que sigue estando entre las enfermedades infecciosas más importantes, con casi la mitad de la población mundial en riesgo, lo que resultó en 241 millones de casos clínicos y 627 000 muertes solo en 202022. Más del 96% de las muertes ocurren en África, casi todas debido a la especie Plasmodium falciparum, aunque al menos otras cuatro especies representan infecciones humanas en todo el mundo. La malaria representa un caso de uso potencialmente ideal para PAFC, ya que la invasión y el crecimiento del parásito en los glóbulos rojos es seguido por la generación de Hz ricos en hierro, que se pueden detectar explotando contrastes de PA análogos a lo que se detecta en CTC de melanoma21 dadas las similitudes en propiedades ópticas y geométricas entre melanina y Hz14. El estándar de oro para el diagnóstico de la malaria ha sido la microscopía óptica de muestras de sangre, que permite la especiación y la cuantificación de parásitos, aunque las pruebas cualitativas de diagnóstico rápido (PDR) más nuevas han superado rápidamente a la microscopía en entornos endémicos23,24,25,26,27,28,29 ,30,31,32,33. Desafortunadamente, ambos diagnósticos en el punto de atención tienen una sensibilidad limitada, con límites de detección de 50 a 200 glóbulos rojos infectados con paludismo (iRBC)/µL, tardan al menos de 20 a 30 minutos en realizarse, y las PDR se ven cada vez más obstaculizadas por las eliminaciones del antígeno objetivo. Si bien la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional y, en especial, los métodos basados ​​en ARN han mejorado la sensibilidad hasta 1 parásito/µL o más, su utilidad en entornos de punto de atención es limitada debido a las demandas de tiempo, maquinaria y consumibles, así como ser propenso a errores, ya que pequeñas cantidades de contaminante pueden conducir a un diagnóstico erróneo23.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) busca reducir las muertes relacionadas con la malaria en al menos un 90% a nivel mundial en o antes de 203022, pero actualmente, ninguna prueba de malaria en el mercado tiene un costo razonable o es lo suficientemente sensible para identificar individuos asintomáticos, un reservorio que representa un obstáculo crítico en la erradicación de la malaria. Nuestro trabajo puede abordar la solicitud de la OMS mediante el desarrollo del dispositivo portátil, no invasivo (sin aguja), sin etiquetas (sin agentes de contraste) y seguro (sin daños en la piel, dolor o problemas de contaminación de la sangre) requerido. Aquí informamos el uso de una nueva plataforma de citofono de arco iris (multicolor) con diodos láser pequeños y rentables para la detección rápida (en segundos) y la identificación en tiempo real de glóbulos rojos infectados con Plasmodium in vitro y en un modelo murino in vivo con un alto potencial para la traducción a los seres humanos.

La característica distintiva de la nueva plataforma Rainbow Cytophone (Fig. 1a) es su uso de una matriz de diodos láser multiespectral que produce pulsos láser con diferentes longitudes de onda y el tiempo de retardo para la codificación de tiempo y color (Fig. 1b). Para validar esta plataforma, aplicamos pulsos de diodo láser de nanosegundos (15 a 25 ns), alta tasa de repetición de pulso (1 a 3 kHz) en dos longitudes de onda, 808 nm y 915 nm. La irradiación transcutánea con láser de los vasos a través de la piel intacta conduce a un aumento de la temperatura en los agentes de contraste PA que absorben la luz, como la Hb en los glóbulos rojos normales (nRBC) y Hz con una mayor absorción local en los iRBC que en la Hb en los nRBC en el infrarrojo cercano. (NIR) región (Fig. 1c). La rápida expansión térmica de las zonas calentadas conduce a la generación termoacústica de ondas acústicas denominadas señales PA que se detectan con un transductor de ultrasonido (US) pequeño (de unos pocos mm de diámetro) (Fig. 1a).

Plataforma de diagnóstico in vivo rainbow Cytophone. (a) El principio del citófono de dos colores; las inserciones muestran un esquema de la estructura iRBC (arriba, izquierda) y una imagen fototérmica (PT) de un iRBC real (abajo, derecha) con picos de Hz. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b). Codificación de tiempo y color de dos pulsos láser de alta tasa de repetición con diferentes longitudes de onda de λ1 y λ2 (arriba) para la identificación espectral de iRBC (centro) en el fondo de señales falsas sincronizadas (p. ej., de piel pigmentada) y no sincronizadas ( abajo). (c) Espectros de absorción de melanina, nRBC, Hz, verde de indocianina (ICG) y perlas magnéticas14,15,16,17,18,19,20,21. ( d ) Trazos de PA con contraste de PA positivo y negativo contra un fondo de sangre creado por muchos nRBC y coágulos de sangre circulantes (CBC).

Las señales de PA de Hb en nRBC en el volumen de detección crean una línea de base de seguimiento (Fig. 1d). Cuando los iRBC con una mayor absorción óptica local relacionada con Hz por encima del fondo de Hb de los nRBC pasan el volumen de detección (es decir, irradiado), la absorción correspondiente aumenta, generando picos de PA transitorios positivos agudos sobre el fondo de la sangre. A modo de comparación, los coágulos de sangre circulantes (CBC) blancos y rojos producen picos de PA negativos y positivos (Fig. 1d).

Con base en las características distintivas de los espectros de absorción de Hz en iRBC y Hb en nRBC, específicamente su absorción diferencial en la ventana espectral de 770 a 930 nm, seleccionamos el modo de dos colores para demostrar la capacidad de Cytophone para identificar espectralmente iRBC con dos láseres. pulsos a 808 y 915 nm y un retardo de tiempo electrónico corto τE (10 μs) para la codificación de tiempo y color (Fig. 1b, arriba). Estos pulsos con una tasa de repetición de 3 kHz interactúan con las mismas celdas individuales de movimiento rápido, lo que genera señales de PA codificadas por colores en el tiempo de las mismas celdas cuando pasan el volumen de detección (Fig. 1a). Específicamente, los iRBC producen señales PA con amplitudes más altas a 808 nm que a 915 nm (Fig. 1b, centro), mientras que los nRBC generan señales PA con amplitudes más altas a 915 nm que a 808 nm como para los CBC rojos (Fig. 1b, abajo, bien). La combinación de la codificación de pulsos láser de tiempo y color con la detección de señales PA resueltas en el tiempo también permite la identificación de un par de señales PA verdaderas sincronizadas de iRBC en el vaso que llega al transductor (Fig. 1a) con un tiempo acústico bien resuelto. retardo τA (≥ 0,2 µs) en comparación con las señales de fondo sincronizadas emparejadas de la capa de piel pigmentada (Fig. 1b, abajo, izquierda), así como las señales falsas no sincronizadas con pulsos de láser (Fig. 1b, abajo, centro) de diferentes orígenes (p. ej., de vibraciones, acústica ambiental e interferencias electromagnéticas).

En el citófono, después del llamado sistema de colimación de eje rápido (FAC) (Fig. 2a,b) que utiliza una matriz de microlentes, los haces de dos diodos láser se mezclan en la dirección coaxial con un espejo dicroico (Fig. 2a) . La óptica de enfoque, que consiste en una lente esférica y cilíndrica, forma un haz lineal con un ancho de aproximadamente 80 µm y una longitud de 1 mm. Los dos conjuntos de emisores compactos (Fig. 2b) proporcionan dos pulsos de longitud de onda (Fig. 2c) con una energía de 110 a 130 µJ. La dispersión de la luz en el biotejido da como resultado una borrosidad del rayo láser que disminuye significativamente la resolución óptica (Fig. 1a). Para proporcionar una resolución espacial más alta, aplicamos el esquema de Cytophone de resolución acústica utilizando el transductor de EE. UU. cilíndrico enfocado con una resolución lateral de 65 ± 9 µm. La configuración del transductor cilíndrico nos permite minimizar el volumen de detección y, por lo tanto, el fondo de sangre de los nRBC, lo que maximiza la relación señal-ruido (SNR) de los iRBC y, al mismo tiempo, evalúa todos los iRBC en toda la sección transversal del vaso sanguíneo. Para recopilar señales de megafonía con las formas de onda bipolares típicas (Fig. 1b, centro), la plataforma estaba equipada con una placa convertidora de analógico a digital. Las formas de onda de la señal PA se promediaron de 4 a 16 veces para aumentar la SNR, luego se transformaron en trazas en una citometría de flujo análoga a la convencional12 (Fig. 1d). Como resultado, Cytophone genera picos de trazas con contrastes positivos y negativos sobre un fondo de sangre (Fig. 1d). A continuación, se analizaron las características (p. ej., amplitud y anchura) de cada pico por encima del nivel de fondo establecido utilizando un software personalizado basado en MATLAB.

Configuración de citófono de dos colores in vivo con dos diodos láser. (a) Esquema óptico. (Adobe Fireworks CS5, www.adobe.com) (b) Fotografía de dos módulos de diodo láser con dos longitudes de onda. ( c ) Espectros de emisión de diodo láser con longitudes de onda centrales de 808 y 915 nm. ( d ) Imágenes de microscopio PA del fragmento de oreja de ratón a 532 nm (arriba) y 820 nm (abajo). FAC = sistema de colimación de eje rápido; ADC = convertidor de analógico a digital.

Para explorar si la plataforma Cytophone de resolución acústica con diodos láser avanzados puede proporcionar valor de diagnóstico y alta especificidad espectral, comparamos su rendimiento in vivo e in vitro con PAFC convencional, que utiliza láseres sólidos en longitudes de onda de 532, 671, 820 y 1064 Nuevo Méjico. Para ello, utilizamos nuestros fantomas de vasos avanzados38,39 y agentes de contraste PAFC relacionados con la enfermedad, incluidas perlas magnéticas que imitan los CTC de melanoma38. Los agentes se administraron por vía intravenosa o peritoneal en el cuerpo del ratón, seguido de la detección de PA en vasos del oído de 40 a 60 µm de diámetro (Fig. 2d). El contraste PA de los vasos sanguíneos a 820 nm fue menor que a 532 nm (~ 20 veces), lo que se correlaciona con el espectro de absorción de Hb (Fig. 1c). Esta firma espectral aumenta el contraste PA de los iRBC por encima del fondo sanguíneo porque la absorción de Hz en los iRBC solo disminuyó ligeramente.

El citófono de dos colores con diodos láser de dos longitudes de onda se validó inicialmente in vitro a través de la identificación espectral de agentes de contraste PAFC tradicionales en condiciones dinámicas usando nuestro fantoma dinámico de vasos sanguíneos con células sanguíneas de movimiento rápido, CTC y fantomas de coágulos en condiciones de flujo bien controlables38 ,39. Este fantasma estaba compuesto de plastisol de cloruro de polivinilo con nanopartículas de TiO2 que modelaban biotejido con propiedades de absorción y dispersión médicamente adecuadas, una capa superficial de melanina que imitaba la piel pigmentada, tubos de plástico con diferentes diámetros y profundidades que imitaban los vasos sanguíneos y una bomba para mover células fantasma y células reales con velocidades de 0,5 a 5 cm/s. Para imitar el flujo de células y los artefactos que pueden producir señales falsas, probamos (1) perlas magnéticas de 8 µm con absorción en el rango NIR, similar a la de las células de melanoma (Fig. 1c); (2) agregados de glóbulos rojos en sangre humana que imitan los glóbulos rojos rojos; 3) perlas de sílice ópticamente transparentes de 100 µm como fantasmas de CBC blancos; (4) tinte verde de indocianina (ICG) para proporcionar un fondo de absorción a granel con agregados de ICG como fantasmas CBC rojos; y (5) Hz disponibles comercialmente.

En nuestro estudio inicial, utilizamos colorante ICG con un espectro de absorción bien caracterizado a una longitud de onda máxima cercana a 808 nm (Fig. 1c) para estimar el rendimiento del citófono de dos colores. Usando microscopía de campo claro convencional, identificamos la presencia de pequeños agregados de ICG en una solución relativamente homogénea (Fig. 3a, derecha). La mayor absorción local de los agregados de ICG por encima de la solución de fondo de absorción de ICG condujo a la generación de picos de PA positivos agudos por encima de la línea de base en flujo con una velocidad de 1 cm/s en un fantoma de vaso de 1 mm de diámetro (Fig. 3a, izquierda) . Estos picos aparecieron preferentemente a 808 nm ya que la absorción óptica de ICG a 915 nm (segundo color utilizado) es aproximadamente 9 veces menor que a 808 nm (Fig. 1c).

Validación del rendimiento del citófono de dos colores (808 nm/915 nm) a través de la identificación espectral de dianas PA convencionales con contrastes positivos y negativos in vitro utilizando el maniquí dinámico de vasos. ( a ) Trazos de PA con los picos de contraste positivo de agregados raros de verde de indocianina (ICG) en una solución de ICG relativamente homogénea (izquierda) e imagen de campo claro del agregado de ICG (derecha). (b) Rastros PA de dos colores de agregados de glóbulos rojos en sangre con artefacto de "un color" (izquierda) e imagen de campo claro del agregado de glóbulos rojos (derecha). (c) Picos de PA de contraste negativo de perlas de sílice como fantasmas de coágulos sanguíneos circulantes (CBC) blancos (izquierda) e imagen de campo claro de una sola perla (derecha). ( d ) Picos de PA de contraste positivo y negativo de CBC rojos y blancos en sangre (izquierda) e imagen de campo brillante de CBC mixtos rojo-blanco en la sangre (derecha). (e) Señales PA de contraste positivo de dos colores de perlas magnéticas de 23 µm en el fondo de muchas perlas magnéticas de 8 µm. (f) Picos de PA positivos de dos colores de sintético ~ 200 µm Hz.

A continuación, obtuvimos picos de PA de dos colores (Fig. 3b, izquierda) de agregados de glóbulos rojos en sangre (Fig. 3b, derecha). Las amplitudes máximas de PA a 808 nm y 915 nm son consistentes con el espectro de absorción de RBC (Fig. 1c). También observamos un solo pico a 808 nm, que está asociado con el agregado de ICG agregado. Estos datos sugieren que un citófono de dos colores tiene el potencial de identificar un objetivo seleccionado (es decir, CBC rojos) en presencia de otros artefactos basados ​​en huellas dactilares específicas.

Para evaluar más a fondo el rendimiento del citófono de dos colores, estimamos su capacidad para identificar CBC blancos que proporcionan picos de contraste negativos debido a una menor absorbancia que los fondos relacionados con nRBC (Fig. 1d). Se creó una suspensión agregando 30 mg de perlas de sílice de 100 µm de diámetro (Fig. 3c, derecha) a 1,5 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), y la suspensión se agitó cada 15 minutos para evitar la sedimentación y agregación de micropartículas. Luego agregamos solución ICG para modelar un fondo de sangre. Observamos picos de PA estrechos de contraste negativo de dos colores (808 nm/915 nm) asociados con la caída repentina de la absorbancia en el volumen de detección a medida que las perlas de sílice transparentes individuales pasaban a través del área del rayo láser (Fig. 3c, izquierda). Los CBC rojos y blancos mixtos en sangre humana (Fig. 3d, derecha) crearon picos de PA de contraste positivo y negativo a 915 nm (Fig. 3d, izquierda). En el pasado, hemos utilizado láseres sólidos de nanosegundos para obtener contrastes PA negativos comparables16,46 utilizando parámetros CBC similares. La similitud en estos resultados indica la posibilidad de reemplazar los láseres sólidos con diodos láser para la misma aplicación.

A continuación, utilizamos perlas magnéticas de 23 µm relativamente raras en el fondo de muchas perlas magnéticas de 8 µm (40 µL de perlas al 1 % en 3960 µL de PBS), para servir como sustitutos de los fantasmas CTC y nRBC38, respectivamente. Observamos muchos picos positivos estrechos transitorios de dos colores (808 nm/915 nm) de las perlas magnéticas individuales relativamente grandes sobre el "fondo de sangre" modelado por perlas pequeñas (Fig. 3e). Las amplitudes máximas de PA (rojo, 808 nm; azul, 915 nm) coinciden con el espectro de absorción de las micropartículas magnéticas (Fig. 1c). Estos datos son muy similares en SNRs en el rango de 5 a 12 medidos previamente con un láser de 1.064 nm en condiciones similares38. Nuevamente, esta sensibilidad comparable indica la posibilidad de utilizar los diodos láser en una aplicación similar.

Finalmente, para verificar el potencial de los diodos láser para detectar Hz asociados con la malaria, intentamos la detección in vitro de Hz disponibles comercialmente, cuyos espectros de absorción óptica y morfología (tamaño y forma) (Fig. S1) son similares a los Hz nativos30,31, 32,33. Nuestros resultados demuestran que Cytophone puede detectar mejor Hz con amplitudes de señal PA a 808 nm que a 915 nm (Fig. 3f), lo que se correlaciona con el espectro de absorción de Hz (Fig. 1c).

En conclusión, usando condiciones de flujo in vitro, demostramos que la plataforma Cytophone con diodos láser tiene el potencial para detectar e identificar múltiples objetivos (p. ej., agregados ICG, perlas magnéticas, CBC blancos y rojos y Hz).

Después de una verificación exhaustiva in vitro con agentes de contraste que están bien establecidos para las técnicas de PA, probamos el rendimiento de Cytophone in vivo al monitorear las señales de PA de los microvasos del oído en ratones control e infectados (Fig. 2d). Los datos recopilados de la primera cohorte de 5 ratones sanos se utilizaron para optimizar aún más los parámetros. La sonda PA, que consiste en una punta de enfoque óptico y un transductor enfocado en ecografía, se colocó en la piel de la oreja por encima de la vena seleccionada y el gel de ecografía estándar proporcionó acoplamiento acústico. La navegación del volumen focal del transductor en la vena examinada se controló con precisión mediante imágenes ópticas y monitoreo de las señales PA mientras la sonda PA exploraba en diferentes direcciones (Fig. S2). Las amplitudes de la señal PA de las venas seleccionadas fueron 1,65 ± 0,32 (SD) veces mayores que las señales de fondo de la piel. Las señales de megafonía con anchos típicos de 0,06 a 0,1 µs (Fig. 4a) procedían de los recipientes con una profundidad típica de 200 a 250 µm al transductor con un retardo de tiempo acústico bien definido (0,15 a 0,3 µs). Esto nos permitió eliminar fácilmente la influencia de las señales de fondo de megafonía de la piel en la sensibilidad del citófono mediante la detección de megafonía resuelta en el tiempo de las señales de los objetos en circulación solamente. Como resultado, no se observaron señales PA positivas transitorias por encima del fondo de sangre establecido en dos longitudes de onda en ratones de control (Fig. 4b). La fluctuación de baja amplitud del fondo sanguíneo (línea de base), típicamente del 3 % al 5 %, depende de la fluctuación de la energía del láser, el ruido eléctrico y acústico, la vibración, el movimiento fisiológico y una ligera fluctuación en la cantidad de nRBC en el volumen de detección. . El número de nRBC es más profundo en vasos pequeños (10–15 µm).

Seguimiento in vivo de trazas de PA de dos colores (808 nm/915 nm) en ratones de control e infectados con malaria con parásitos P. yoelii GFP+. ( a ) Detección resuelta en el tiempo de la forma de onda de la señal PA en un ratón de control de un vaso del oído en comparación con la piel. ( b ) Rastros de PA in vivo de un ratón sano (control). ( c ) Rastros de PA in vivo de un ratón no infectado con agregados de glóbulos rojos. Rastros de PA in vivo de un ratón infectado a los 13 (d), 16 (e) y 21 (f) días después de la infección. ( g ) Verificación in vivo de los datos de citofono basados ​​​​en diodos láser mediante la prueba del mismo ratón infectado utilizando la plataforma PAFFC que integra PAFC (traza inferior) y el módulo de citometría de flujo fluorescente (FFC) (traza superior). ( h ) Dependencia in vivo de las tasas de PA (número de señales de PA por minuto) en el tiempo después de la infección.

A continuación, probamos la capacidad del citófono para detectar agregados de glóbulos rojos (es decir, CBC rojos ricos en Hb) in vivo. Usando procedimientos bien establecidos12,21,46 y baja temperatura, creamos agregados de glóbulos rojos que se identificaron con imágenes ópticas de alta velocidad46. Los agregados que se movían a través del volumen de detección (irradiado) crearon picos de PA positivos transitorios simultáneamente en canales de dos colores (Fig. 4c). Las amplitudes con la misma energía láser fueron un poco más altas (15–20 %) a 915 nm que a 808 nm en línea con los espectros de absorción de la sangre (Fig. 1c).

A continuación, se inyectaron por vía intraperitoneal P. yoelii que expresan GFP en los ratones14. La parasitemia se evaluó monitoreando las amplitudes y tasas de la señal PA (número de señales PA por unidad de tiempo) diariamente durante aproximadamente un mes (ver ejemplos seleccionados en la Fig. 4d-f). Para verificar los datos obtenidos con diodos láser, probamos los mismos ratones con nuestro sistema PAFC integrado más establecido y citometría de flujo de fluorescencia (FFC) (denominado PAFFC)14 usando un láser sólido pulsado a una longitud de onda de 671 nm para generar señales PA como así como un láser de onda continua (CW) a 488 nm para excitar la emisión en parásitos que expresan GFP. La capacidad PAFFC multimodal nos permitió identificar los iRBC a través de la coincidencia temporal de las señales FL y PA de parásitos que contienen GFP y Hz dentro de los iRBC, respectivamente (Fig. 4g). La presencia de un pico de PA solamente (es decir, picos no relacionados con FL) indicaba que el Hz estaba solo en el plasma sanguíneo o absorbía Hz en los glóbulos blancos (p. ej., neutrófilos)14,26.

En general, PAFFC confirmó los datos de Cytophone que indicaban la presencia de iRBC en los mismos ratones infectados. El monitoreo de las señales de PA durante un mes en ratones infectados reveló la siguiente tendencia durante la progresión de la malaria: (1) aumento gradual de la tasa de señal durante los primeros 15 (comenzamos el día 13) a 16 días; 2) alcanzando un máximo a los 15 a 17 días; y (3) disminución eventual hasta la desaparición total a los 28–30 días (Fig. 4h) que está en línea con nuestro estudio anterior14,15. Este patrón está bien descrito y está relacionado con el aclaramiento inmunomediado en el modelo de ratón14. Los datos obtenidos con diodos láser están en línea con los datos obtenidos con láseres sólidos14,18, con algunas características ligeramente diferentes según la ubicación del vaso, la velocidad de flujo y la respuesta inmune.

El monitoreo PA in vivo de Hz artificiales, NP magnéticos y células de melanoma B16F10 inyectadas en una vena de la cola reveló que los NP magnéticos y las células de melanoma (Fig. S3) se eliminaron relativamente rápido (20 minutos a unas pocas horas), lo que es consistente con nuestro resultados previos9,12. Durante el escaneo de la sonda PA a lo largo de los vasos, observamos señales PA estacionarias con una distribución espacial aleatoria. Estas señales eran relativamente estables en amplitud y se distinguían bien de picos de PA transitorios agudos (es decir, de corta duración) producidos por iRBC de movimiento rápido. Este hallazgo sugiere la posible presencia de iRBC secuestrados (es decir, adheridos a las paredes de los vasos). Cabe destacar que el secuestro de glóbulos rojos i en los vasos endoteliales y otros tejidos es un fenómeno bien descrito en la malaria23,25.

A continuación, analizamos muestras ex vivo de ratones infectados con Plasmodium con las mismas plataformas de citofono/diodos láser y PAFFC/láser sólido usando nuestro maniquí dinámico de vasos sanguíneos con muestras de sangre fluyendo38,39. No se observaron señales por encima de los niveles de ruido establecidos en las muestras de sangre de las muestras de sangre de control (es decir, ratones no infectados) ni con el citófono de dos colores (Fig. 5a) ni con el PAFFC multimodal (Fig. 5c). Por el contrario, tanto las señales de PA relacionadas con Hz como las señales de FL asociadas a GFP de iRBC con P. yoelii que expresan GFP se observaron con una tasa similar en la misma etapa de infección que se observó con datos in vivo emparejados. Específicamente, la coincidencia temporal de los picos de PA de dos colores (Fig. 5b) se correlacionó con los espectros de absorción de Hz (Fig. 1c), lo que indica claramente el origen relacionado con Hz de las señales de PA. Además, la coincidencia temporal de las señales PA y FL (Fig. 5d) confirma esta conclusión, considerando que Hz debe ubicarse dentro de los iRBC de P. yoelii que expresan GFP. Las amplitudes de señal PA asociadas a Hz suficientes para la identificación fueron inducidas por diodos láser por encima del ruido de fondo (Fig. 5b) y fueron comparables con las inducidas por láseres sólidos (Fig. 5d). Esto valida la capacidad de Cytophone para detectar Plasmodium-iRBC. Además, la SNR para los canales PA era típicamente más alta que en los canales FL, lo que indica la ventaja de Cytophone como plataforma de diagnóstico en comparación con los módulos FFC. Además, FFC requiere el etiquetado de iRBC in vivo, lo cual no es fácil, y la mayoría de las etiquetas FL son tóxicas para los humanos.

Verificación ex vivo de datos de citotófono in vivo utilizando el fantoma de vasos sanguíneos. Traza de PA de dos colores de (a) control (ratón no infectado) y (b) sangre de ratón infectada con GFP + P. yoelii a los 13 días después de la infección usando Cytophone con dos diodos láser a 808 nm y 915 nm. (c) Rastros fluorescentes y PA de sangre de control utilizando la plataforma PAFFC (que integra módulos PAFC y FFC) con láseres de pulso a 671 nm y láseres de onda continua a 488 nm para la generación de señales PA y fluorescentes (FL). ( d ) Rastreo fluorescente y PA ex vivo de sangre de ratón infectado con GFP + P. yoelii en el día 13 usando la plataforma PAFFC. Se obtuvieron trazas de PA de dos colores con una plataforma Cytophone de dos colores utilizando láseres a 671 nm y 820 nm de (e) sangre humana de control y (f) P. falciparum-iRBC de cultivo in vitro. ( g ) Fragmento de traza, que demuestra la coincidencia temporal de los picos de PA en diferentes longitudes de onda del mismo iRBC.

Para verificar los datos de PA, también aplicamos microscopía fototérmica confocal (PTM)40,41,42,43,44,45, una técnica que hemos desarrollado, que tiene principios físicos muy similares a las técnicas de PA (es decir, transformación de la energía luminosa absorbida en calor) pero con una mejor resolución de imágenes in vitro40,41,45. Mientras que Cytophone detecta ondas PA debido a la expansión térmica de las zonas calentadas, en PTM, los efectos térmicos se detectan mediante el desenfoque del haz de la sonda debido a los cambios en el índice de refracción sensible a la temperatura40,41,42,43,44,45. Las ventajas de PTM in vitro, en comparación con otras técnicas ópticas, son su sensibilidad y resolución espacial mejoradas41, lo que nos permite verificar la capacidad del citófono para identificar nanocristales de un solo Hz mediante su visualización basada en PTM solo o dentro de las células. Como se mencionó, utilizamos Hz disponibles comercialmente con propiedades similares a los Hz naturales30,31,32,33. Los instrumentos TEM, STEM y EDS (Fig. 6a-c; Fig. 1Sa-d complementaria) demostraron una alta heterogeneidad en el tamaño y la forma de Hz, comenzando durante el proceso de nucleación inicial como nanocristales esféricos cúbicos no ideales con un tamaño mínimo de 60 a 80 nm y transformándose en estructuras alargadas con una relación de tamaño (lado largo a corto) de 2:1, y en su mayoría 3:1 con una longitud máxima de hasta 1 mm. Durante su crecimiento, los nanocristales individuales pueden formar una cadena de nanocristales individuales ("grupo lineal"). A alta concentración, los Hz se agregan con frecuencia, con un tamaño de grupo de Hz promedio entre 250 y 500 nm con una mediana de 320 nm. A diferencia de TEM y STEM, PTM normalmente no requiere una preparación altamente específica y que consuma mucho tiempo (solo unos minutos). Con una lente objetivo de 40 ×, las imágenes PTM de Hz mostraron resultados similares, incluida cierta heterogeneidad (Figs. 6e-g) con una distribución de tamaño bastante simétrica alrededor de un valor medio de 330 nm (Fig. 6i). Después de la desintegración por ultrasonido de los grupos de Hz, PTM con una lente de objetivo de 100 × pudo distinguir nanocristales de Hz individuales con resolución limitada por difracción a un nivel de 220 nm (Fig. 6f). Estos nanocristales proporcionaron señales PA bien detectables (p. ej., Figs. 3f y S3a) con amplitudes comparables o superiores a las de las nanopartículas de melanina en células de melanoma (Fig. S3b, c). Debido a que el uso de técnicas PA y PT para estudiar el melanoma está bien establecido21, estas técnicas se pueden adoptar fácilmente para la detección de la malaria con diodos láser que pueden reemplazar las fuentes láser tradicionales.

Caracterización de hemozoína (Hz) sola utilizada para la calibración de sistemas de citófonos y PTM. ( a ) Imagen STEM de grupos de Hz. Imágenes TEM de un solo (b) y agrupado (c) Hz. ( d ) Espectro de absorción de Hz sintéticos. Absorbancia espectral de Hz y micropartículas magnéticas de comparación con un diámetro de 5,5 µm. Imágenes de transmisión/campo brillante (e) y (g) y fototérmicas (f) y (h) de pequeños Hz individuales en baja concertación (5 µg/mL) después del tratamiento con ultrasonido (24 kHz, 5 min) y Hz agrupados en alta concertación (25 µg/mL). ( i ) Histograma de distribución de tamaño de cristal de Hz obtenido con microscopía fototérmica (PTM); las barras de error presentan desviación estándar, n = 55.

Después de la caracterización de PA y PT de Hz sintéticos, recolectamos muestras de sangre de ratones C57BL / 6 infectados por vía intraperitoneal con un P. yoelii 17XNL que expresa GFP. Se aplicaron técnicas de transmisión (campo brillante), fluorescente y PTM para obtener imágenes de células individuales en muestras de sangre teñidas con yoduro de propidio (PI) para la selección de parásitos en diferentes etapas de desarrollo, desde anillos tempranos hasta esquizontes maduros (Fig. 7). Si bien las imágenes de transmisión proporcionaron poca o ninguna información estructural sobre los parásitos y Hz dentro de los iRBC, las plataformas confocales fluorescentes (FL) y PTM en combinación distinguieron claramente los parásitos marcados con PI y Hz, respectivamente, entre los fondos de absorción asociados con Hb y autofluorescentes dentro de los RBC. Específicamente, la microscopía PTM confocal integrada y FL confocal mostró tanto Hz como co-localización de parásitos en glóbulos rojos de ratón infectados con P. yoelii con buena resolución y alto contraste de imágenes. PTM permitió la visualización de la distribución intracelular de Hz y sus agregados (Fig. 7b, c; Fig. S4c-e), que no son visibles con microscopía de transmisión convencional (Fig. 7a). Dentro de las 2 a 4 h de la invasión, la forma de los glóbulos rojos se transformó de la discoide bicóncava tradicional a una forma esférica más pequeña. En la etapa de trofozoíto, los parásitos consumieron casi por completo el contenido de Hb, lo que condujo a la formación de múltiples cristales de Hz, que fueron visibles en los glóbulos rojos con un fondo de Hb reducido o incluso sin Hb en comparación con los glóbulos rojos n (Fig. 7c, Fig. S4c). Solo PTM pudo monitorear los detalles intercelulares de la progresión del parásito desde las etapas iniciales del anillo (Fig. 7a, b) hasta la etapa de esquizonte acompañada por la liberación de Hz de los glóbulos rojos al plasma (Fig. S4f). En algunas muestras de sangre, pudimos observar glóbulos blancos con Hz ingeridos (Fig. 7d) en comparación con el control sin Hz (Fig. S4a).

Las imágenes ópticas de células de control e infectadas con P. yoelii se tiñeron con yoduro de propidio (PI). Columna: Imágenes de transmisión (primera), fluorescente (segunda), microscopía fototérmica (PTM) (tercera) e integrada (cuarta) de células sanguíneas de ratón. ( a ) Etapa de anillo temprano (2 a 4 h después de la infección) con un solo parásito en RBC sin signos de Hz todavía. (b) Etapa de trofozoíto (6 a 10 h después de la infección) con un solo parásito en RBC con uno o pocos Hz. ( c ) Etapa de esquizonte madurado (24 h después de la infección) con muchos parásitos y Hz. (d) Hz en glóbulos blancos sin signos de parásitos y Hz en glóbulos rojos (24 h después de la infección).

Nuestros estudios de paludismo murino, tanto in vivo como ex vivo, demostraron con éxito la capacidad de la nueva plataforma arcoíris para detectar y resolver Hz derivados de Plasmodium dentro de los glóbulos rojos, por lo que luego probamos el citofono arcoíris en el patógeno humano, P. falciparum. Las muestras congeladas de la cepa 3D7 de P. falciparum se descongelaron utilizando un procedimiento establecido de varios pasos (ver Métodos)23,24,25,26. Los cultivos de parásitos se sincronizaron con una solución de sorbitol al 5 % para incluir solo parásitos en etapa anular de 0 a 12 horas después de la infección. Se tomaron nueve muestras en total de los cultivos sincronizados, incluidos los siguientes puntos de tiempo después de la infección de eritrocitos: 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36 –40 h, 42–46 h y 48–52 h.

No se observaron señales en muestras de sangre de control no infectadas (Fig. 5e). Usando parásitos cultivados in vitro, el Hz inducido por P. falciparum en iRBC (Fig. 5f, g) generó señales PA más grandes que los RBC infectados con P. yoelii ex vivo (Fig. 5b, d), lo que indica el prometedor potencial clínico de Cytophone para diagnóstico de paludismo. Por lo tanto, los datos indican que la sustitución de los láseres sólidos por diodos láser multicolor más pequeños y más rentables es adecuada para la detección de parásitos de la malaria.

Para investigar la aparición de parásitos P. falciparum en diferentes etapas del ciclo de vida eritrocitario, nuevamente empleamos técnicas de transmisión (campo brillante), fluorescente y PTM para células individuales en muestras de cultivo en sangre teñida con PI (Fig. S5). Las imágenes se obtuvieron antes de la invasión de glóbulos rojos (a), poco después de la invasión (dentro de las 4 h) con la formación de Hz únicos y agrupados (b, c), etapas maduras (24 h después de la infección) con múltiples parásitos probablemente esquizontes y Hz (d ), y un caso único de parásito liberado con Hz dentro (e). Debe enfatizarse que pudimos identificar eventos de formación de Hz en las primeras etapas de la invasión (dentro de las 4 h). Los datos de PTM también se pueden presentar en simulación 3D (Fig. S6), así como en video con rotación 3D (Video complementario), lo que permite una localización espacial más precisa de Hz con PTM de alta resolución. Los datos de PT se correlacionaron bien con la tinción convencional de portaobjetos de P. falciparum en diferentes puntos de tiempo de 0 a 4 h a 48 a 52 h (Fig. S7).

En este trabajo, demostramos por primera vez que nuestro citófono de dos colores con diodos láser avanzados tiene el potencial para un mayor desarrollo como una nueva plataforma de diagnóstico para la detección e identificación de Plasmodium-iRBC, así como varios otros marcadores PA intrínsecos asociados con otras enfermedades de importancia mundial. Demostramos que un citófono con dos pequeños diodos láser (longitudes de onda: 808 nm y 915 nm) puede identificar Hz, un subproducto de la degradación del hemo generado por todas las especies conocidas de Plasmodium, contra un fondo de sangre y artefactos. La sangre no infectada proporcionó rastros de PA sin picos agudos transitorios de PA por encima del fondo de la sangre (Fig. 4b, 5a, c, e), mientras que la sangre infectada con diferentes especies de Plasmodium, incluida la P. falciparum cultivada in vitro, la especie humana más prevalente y virulenta , (Figs. 4d-f, 5b) muestran claramente la posibilidad de identificación bicolor (p. ej., 808 nm/915 nm o 671 nm/820 nm) de picos asociados a Hz con una relación de señal PA específica contra un fondo de normal sangre o artefactos con otras proporciones y/o señales típicamente producidas en una sola longitud de onda. Los espectros de absorción de Hz demostraron una disminución gradual de la absorción con una mayor longitud de onda en el rango NIR con un ligero máximo a 670 ± 2 nm, mientras que la absorción de glóbulos rojos aumenta ligeramente en este rango (p. ej., 700–950 nm [Fig. 1c])32 . Los datos cuantitativos de parasitemia se pueden obtener contando el número de señales de PA por unidad de tiempo (es decir, la tasa de señal) que están asociadas con iRBC individuales durante un tiempo determinado dividido por el volumen de sangre que pasa por el punto de detección durante el mismo tiempo. La tasa de flujo para calcular un volumen de sangre se puede estimar aproximadamente para un vaso examinado a partir de la literatura15 o medirse directamente mediante técnicas de US15 y/o PA9.

Además, hemos demostrado que nuestra integración de PTM y PAFC permitió la detección de pequeños nanocristales de un solo Hz (aproximadamente 100 nm) formados solo unas pocas horas (4 h) después de la invasión de los glóbulos rojos por parásitos (merozoitos), así como agregados de Hz (Fig. 7, S4-6). Usando técnicas de detección convencionales, se pensó que Hz era detectable solo después de 12 horas o más hasta por 24 horas. Solo los métodos magneto-ópticos (MO) han demostrado un potencial para detectar la formación de Hz durante 6 a 10 horas46. Además, según un análisis reciente47, la tasa de cristalización in vivo, un paso importante en la biosíntesis de Hz, se estima en 7.000 hem/s. Teniendo en cuenta que hay aproximadamente de 6 a 10 millones de hemos en un solo Hz, la formación de Hz teóricamente podría comenzar tan pronto como 15 a 24 minutos después de la invasión. Si nuestros datos retrasan el momento de la formación de Hz en los iRBC, es posible que debamos reconsiderar la fisiología del crecimiento temprano del parásito inmediatamente después de la invasión, así como la utilidad potencial de las plataformas avanzadas de PTM y Cytophone para comprender la dinámica de Hz en todo el 48 -h ciclo de vida. Sugerimos que el Cytophone puede tener el potencial para diagnosticar la malaria en etapas tempranas del curso de la infección en la etapa sanguínea14,15, así como a bajas densidades de parásitos, mientras que también puede ser útil en estudios de eficacia y viabilidad de fármacos in vivo23.

Descubrimos que la vida útil de Hz en circulación es relativamente larga (hasta 24 h antes de su eliminación notable por el sistema reticuloendotelial sin degradación de la señal) (Fig. S2), mientras que otros agentes (p. ej., NP de melanina, células de melanoma, colorantes y bacterias) normalmente se eliminan en un tiempo mucho más corto (de 10 minutos a unas pocas horas)9. La cinética de Hz generada biológicamente se ha explorado en la malaria murina y humana y ha demostrado que Hz, una vez liberado, se fagocita rápidamente, con Hz intracelular presente en estos fagocitos hasta que abandonan la circulación. En particular, nuestra plataforma PAFFC multimodal integrada permite la identificación del parásito y la ubicación de Hz en iRBC a través de la coincidencia temporal de las señales correspondientes o extracelularmente en el plasma a través de la presencia de señales únicas de Hz (Figs. 4g, 5d) 14. Creemos que la misma plataforma se puede usar para la identificación de Hz en monocitos y neutrófilos después de la ruptura posterior al esquizonte de iRBC, lo que posteriormente conduce a la liberación de Hz libre en el plasma y luego a su absorción por los fagocitos (Fig. 7d). En particular, los neutrófilos y los monocitos se pueden identificar marcando con anticuerpos contra los marcadores CD11 y CD15, respectivamente, o en combinación. Si bien estos usos están destinados a modelos animales, es de esperar que en el futuro, ICG conjugado o nanopartículas de oro de baja toxicidad aprobadas para un estudio piloto en humanos20 puedan usarse para la localización de Hz en diferentes compartimentos vasculares. Además, nuestro objetivo es aprovechar estos datos para optimizar la capacidad de PAFC in vivo para distinguir Hz intraeritrocíticos de Hz libres y Hz fagocitados. Por otro lado, el despeje de circulación de Hz libres tarda solo unos días48, lo que minimiza el riesgo de falsos positivos.

Como señalamos, utilizando un rayo láser de exploración espacial, la plataforma Cytophone puede identificar la distribución espacial de los iRBC adheridos a la pared del vaso. Si bien nuestros datos son preliminares, planteamos la hipótesis de que esto puede representar un fenómeno central bien conocido para la patogénesis de la malaria, particularmente en P. falciparum, conocido como secuestro. El secuestro de iRBC se produce en la vasculatura periférica, así como en varios tejidos, y aunque esto se ha descrito ampliamente en estudios post mortem humanos y murinos, los datos limitados han demostrado que tales procesos ocurren in vivo sin el uso de marcaje. Se está trabajando más en esta área, incluida la comparación de los resultados de los recuentos de iRBC en venas y arterias15.

Quizás lo más crítico en el desarrollo posterior de la nueva plataforma Cytophone sería la capacidad del dispositivo para diferenciar entre especies de Plasmodium. Debido a que diferentes especies pueden tener espectros de absorción ligeramente diferentes, podría ser posible diferenciar entre especies de Plasmodium mediante la selección de la longitud de onda láser adecuada. Además, diferentes especies producen diferentes tamaños y formas de nanocristales de Hz33. Debido a que la forma de onda de la señal PA depende del tamaño del objetivo2,3, esta puede ser otra forma de identificar diferentes especies. Si bien aún no hemos probado el nuevo Cytophone en diversas especies de malaria humana, nuestros datos demuestran de manera concluyente la capacidad de PAFC para detectar la especie humana más importante, P. falciparum. De hecho, las señales generadas parecían más sólidas que las de las muestras de P. yoelii murino ex vivo. Anticipamos que el PAFC podrá detectar todas las especies, como han demostrado otros dispositivos basados ​​en Hz, y se están realizando estudios adicionales para diferenciar especies en función de los parámetros anteriores.

El citófono arcoíris (es decir, multicolor) presenta diodos láser multiespectrales con muchas longitudes de onda discretas actualmente disponibles que van desde 630 a 1650 nm, así como un modo codificado por colores de tiempo9,19,20, que abre oportunidades únicas para multicolor (hasta 30– 40 colores simultáneamente) citometría de flujo in vivo de múltiples objetivos. De hecho, aunque aplicamos esta nueva plataforma a la malaria en este estudio, los datos obtenidos (p. ej., Fig. 3, 4, 5, S3), así como nuestros resultados publicados previamente con láseres convencionales9,12,16,17,18, 19,20,21,43,44,45,46,49, indican que nuestra plataforma de citofono con diodos láser tan pequeños como unos pocos mm puede tener cierto potencial para el diagnóstico sin etiquetas de melanoma, bacteriemia, anemia de células falciformes (p. , hemoglobinopatías), accidente cerebrovascular, complicaciones relacionadas con COVID-19 (p. ej., coagulación), diferentes formas de Hb, incluidas oxi-, desoxi- y meta-Hb (metahemoglobinemia)19 y algunos trastornos sanguíneos asociados con el transporte inadecuado de oxígeno y la talasemia. Aunque los diodos láser tienen una energía de pulso más baja, en promedio, en comparación con los láseres sólidos, la alta sensibilidad del citófono, junto con el software avanzado y los algoritmos de procesamiento de señales, compensa al menos en parte, si no completamente, esta limitación. Además, el progreso en el desarrollo de matrices de diodos láser potentes con energía de pulso de hasta 1 a 2 mJ37 reducirá significativamente el impacto de esta limitación para las aplicaciones clínicas. Si bien los datos in vivo presentados aquí se limitan en gran medida a la malaria murina, nuestros prometedores datos in vitro de P. falciparum nos han llevado a iniciar un primer estudio piloto en humanos con el Cytophone arcoíris. El trabajo adicional evaluará la capacidad de Cytophone para detectar/distinguir Plasmodia de otros patógenos eritrocíticos como Babesia y Bartonella, lo que anticipamos será factible, dado que ninguno de los dos últimos produce hemozoína.

Hemos demostrado previamente que las señales PA (con anchos típicos de 0,2 a 0,3 µs) tienen un retardo de tiempo acústico bien distinguible (0,5 a 2 µs) de los objetos circulantes en los vasos sanguíneos que son capturados por el transductor sobre la piel en comparación con el fondo. Señales PA de la capa de piel pigmentada21. Por lo tanto, el modo de detección con resolución de tiempo en Cytophone nos permitió eliminar la influencia del fondo de pigmentación de la piel en la sensibilidad de PAFC. En otras palabras, este modo, junto con los algoritmos de procesamiento de señales rápidos, hacen que los datos PA sean tolerantes a la pigmentación de la piel. Además, utilizamos un animal in vivo (Fig. 4a) y un modelo fantasma de vaso compuesto por tubos de plástico y fantasmas de piel38 con una capa de melanina en la superficie del fantasma para evaluar el impacto de la capa de piel en las lecturas de PAFC.

En conclusión, un citófono con diodos láser de pulso multiespectrales codificados por color en el tiempo y procesamiento de señales de resolución temporal de alta velocidad supera las limitaciones anteriores de las técnicas PA, particularmente PAFC asociadas con el uso de láseres sólidos, debido a la complejidad técnica, de gran tamaño, alto costo y una longitud de onda utilizada en la mayoría de las aplicaciones. Nuestros resultados preliminares demuestran la viabilidad de un citófono portátil, potencialmente basado en baterías, con diodos láser. El citófono puede monitorear continuamente, en tiempo real o examinar periódicamente la circulación sanguínea para detectar la aparición de parásitos unas pocas horas después de la invasión. La profundidad del citófono está dentro de la capacidad documentada de las técnicas convencionales de obtención de imágenes PA in vivo para evaluar vasos sanguíneos humanos relativamente profundos (hasta 3–5 cm)2,3,4,5,6,7,8,9. Sin embargo, estas técnicas que utilizan plataformas de microscopía y tomografía son relativamente lentas, lo que dificulta la detección de iRBC en movimiento rápido (3–10 cm/s incluso en vasos de 1 mm de profundidad), iRBC circulantes y otros objetivos, especialmente en vasos grandes y profundos. Nuestros datos anteriores con láseres sólidos de alta repetición de pulsos y ahora con diodos láser sugieren que la plataforma Cytophone basada en PAFC con resolución acústica puede proporcionar detección de alta velocidad e identificación espectral de objetos circulantes de diferentes orígenes en lugares relativamente profundos (1–2 cm) y vasos sanguíneos grandes (4–6 mm) con velocidades de flujo de hasta 10–20 cm/s9,12,21. La capacidad única de interrogar tales vasos mientras se enfoca en el proceso de formación de Hz, fundamental para todas las especies de Plasmodia, ofrece la promesa de un diagnóstico de malaria muy rápido, no invasivo y sin etiquetas para todas las especies. Aprovechando la capacidad de detectar grandes volúmenes de sangre circulante, la sensibilidad del citofono también puede permitir la detección de un gran reservorio de individuos asintomáticos, un avance que podría ayudar a impulsar tanto un mejor control de la malaria como su eventual eliminación. Además, al combinar los datos de este estudio con nuestro trabajo anterior de PAFC, anticipamos que la plataforma Cytophone multicolor puede permitir la detección e identificación de múltiples enfermedades, lo que la convierte en una herramienta portátil no invasiva prometedora en una amplia gama de entornos globales.

La configuración de citófono multicolor basada en PAFC (Fig. 1a, 2a–c) está equipada con dos diodos láser pulsados ​​(MM25004, MM25005, Quantel Laser, Francia) con longitudes de onda de 808 nm y 915 nm (Fig. 2c), anchos de pulso de 27 ns, tasa de repetición de pulso de 1 a 3 kHz y energías de pulso de 140 μJ y 110 μJ, respectivamente. Cada láser tiene 20 emisores con una longitud total de 5 mm y un tamaño de emisor individual de 8 × 200 µm. Ambos diodos láser tenían ángulos de divergencia de salida de 40 grados para el llamado "eje rápido" y 10 grados para el "eje lento" sin componentes ópticos adicionales37,38. Para disminuir el ángulo de divergencia en la dirección del eje rápido a unos 2 grados y para colimar la radiación láser, se agregaron lentes de colimador de eje rápido (FAC), cada uno con una distancia focal de 260 μm y un diámetro de 400 μm. Se utilizaron dos espejos para combinar las radiaciones láser en la misma dirección de propagación. El único espejo era plateado (PF10-03-P01, Thorlabs Inc) para reflejar la radiación láser de diodo de 808 nm y eventualmente coincidir con el diodo láser de 915 nm usando un espejo dicroico (Di02-R830-25 × 36, Semrock, IDEX Health & Science, LLC). Los rayos láser combinados se transformaron aún más en el rayo lineal enfocado mediante una lente esférica (LA1274-B, distancia focal de 40 mm, Thorlabs Inc.) seguido de un condensador cilíndrico asférico (ACL2520-B, distancia focal de 20 mm, Thorlabs Inc. .). El tamaño final del rayo láser fue de 1,8 mm × 65 μm controlado periódicamente con una cámara CMOS (DCC1645C-HQ, Thorlabs, Inc.). Las energías de pulso después de salir del sistema óptico se ajustaron a 80 μJ, lo cual fue adecuado para nuestra aplicación. La energía del láser se controló utilizando un medidor de potencia óptica PM100USB, sensor S314C (Thorlabs, Inc.).

Las ondas acústicas inducidas por láser en las muestras se detectaron con un transductor cilíndrico enfocado hecho a medida (frecuencia central: 51,1 MHz, distancia focal 6 mm, resolución acústica lateral de 65 μm). El transductor se fijó en una etapa de posicionamiento XYZ independiente para permitir el ajuste de su posición con precisión micrométrica. La etapa Z independiente se utilizó para ajustar la lente óptica en la dirección Z para maximizar la amplitud de la señal PA. Para obtener señales PA iguales de ambos diodos láser, primero equilibramos las energías de ambos diodos láser y luego usamos la etapa Z independiente para ajustar la muestra en los puntos óptimos para los focos acústico y óptico moviendo la etapa en la dirección Z. Como resultado, se lograron señales PA máximas iguales de objetos con absorción similar (p. ej., cinta negra) en las longitudes de onda de ambos diodos láser. Se empleó gel ultrasónico convencional para el acoplamiento acústico. Se utilizó un generador de impulsos estándar para generar una señal para impulsar los diodos láser y se envió una señal sincronizada resultante a la placa de adquisición de datos (ATS9350, Alazar Technologies, Inc., Canadá). Las señales de megafonía fueron amplificadas por un preamplificador (AH-2010–100, Precision Acoustics Ltd, Reino Unido).

Los principios de PAFFC que integran los módulos PAFC y FFC se han descrito en detalle en otro lugar14. Brevemente, la configuración se construyó en una plataforma de microscopio Nikon Eclipse E400 (Nikon Instruments Inc., EE. UU.) con tres láseres de nanosegundos (0,6 a 8 ns) de frecuencia de repetición de pulso alta (1–10 kHz) con las longitudes de onda correspondientes de 532 nm, 671 nm, 820 nm, 1060 nm y 1064 nm para la detección de PA y con un diodo láser CW488 nm para la detección de fluorescencia. Utilizamos un láser de fibra Yb YLPM-0.3-A1-60–18 (IPG Photonics Corp.) que opera a una longitud de onda de 1060 nm, una frecuencia de pulso de 1 a 10 kHz y un ancho de pulso de 0,8 a 10 ns. La energía del láser se controló con un medidor de potencia (PM100USB, cabezal S314C, Thorlabs, Inc.). Las señales del fotodetector (PDA10A, 150 MHz, Thorlabs, Inc.) activaron el hardware de adquisición de datos. Para convertir el rayo láser en una línea estrecha (6,5 μm × 780 μm) que cruza el vaso sanguíneo ficticio o real en un modelo animal, utilizamos una combinación de lentes asféricos (C560TME-C) y cilíndricos (LJ1598-L1-C) ( Thorlabs, Inc.).

Las ondas acústicas inducidas por láser se detectaron mediante transductores ultrasónicos personalizados de enfoque cilíndrico con un elemento sensible a la presión de fluoruro de polivinilideno de 28 µm con una respuesta de frecuencia de banda ancha en el rango de 0,2 a 32 MHz y una distancia focal de 6 mm. El transductor se montó en una platina XYZ para permitir un ajuste de posición preciso. Se utilizó una PC para registrar las señales del transductor, las cuales fueron amplificadas por un amplificador (modelo 5662B, 50 kHz—4 MHz, Panametrics). Una placa convertidora de analógico a digital, así como el software LabVIEW y MATLAB, permitieron que la configuración recolectara las señales. Las señales de fluorescencia del tubo fotomultiplicador se muestrearon a una velocidad de 4 MHz y se redujeron a 10 kHz, con un promedio de 400 puntos. Se utilizó un software personalizado para analizar ambas señales, que se mostraron como trazas de señal con el tiempo de aparición, amplitudes, formas y anchos para cada pico superior al nivel de fondo.

El principio general del sistema PTM se ha descrito en detalle en otro lugar34,35,36. Brevemente, la plataforma técnica de imágenes PTM confocales de doble haz colineal (sonda de bomba) se basó en una plataforma de microscopio IX73 (Olympus America, Inc., Central Valley, PA) con diferentes pulsos de alta frecuencia (1–10 kHz). , láseres de nanosegundos (5–10 ns) con longitudes de onda fijas (532/671/820/1064 nm) que usaban una combinación de lentes y fibra óptica para entregar luces láser a las muestras. Esto se logró utilizando un multiplexor por división de longitud de onda de 3 longitudes de onda (WDM-RGB46HF, Thorlabs, Newton, NJ) que combinaba los haces de un láser CW de 473 nm (para excitación de fluorescencia), CW de 532 nm y láseres de pulso (para bombeo de PT y fluorescencia). excitación) y láser CW de 635 nm (sonda PT) en una fibra monomodo. Dependiendo de la aplicación, este esquema permite al usuario cambiar entre fuentes de láser de bomba CW y pulsadas para obtener imágenes de PT sin comprometer la alineación del sistema. Primero, usamos esquemas de bombeo convencionales con un láser CW que opera a 532 nm. La intensidad del láser se moduló utilizando un modulador electroóptico (EOM-NR-C4, Thorlabs, Newton, NJ) a una frecuencia de 100 kHz. Los fenómenos de PT resultantes de la absorción de la luz láser de bombeo se detectaron mediante la modulación de la intensidad del haz de la sonda utilizando un fotodiodo con un amplificador de bloqueo (SR530, Stanford Research Systems, Sunnyvale, CA). En segundo lugar, se utilizó un láser pulsado de 532 nm (Modelo, LUCE 532; ancho de pulso, 5 ns; frecuencia de pulso, 10–30 kHz; Bright Solutions, Italia) para inducir efectos de PT lineales y no lineales en la muestra. La intensidad de este láser se moduló a través del mismo modulador electroóptico para cambiar rápidamente la energía del pulso entre pulsos utilizando señales PT como retroalimentación para evitar daños en la muestra. Para proporcionar una configuración de PT confocal, se colocó un orificio de fotodetector en un plano situado a un rango de Rayleigh del "plano de la cintura" del haz de la sonda. Por lo tanto, el agujero de alfiler permite la detección de efectos de lente térmica altamente localizados dentro de objetivos de absorción individuales mientras elimina la influencia de las señales PT desenfocadas. Para las imágenes en 3D, se adquirieron imágenes PT sucesivas en planos x-y paralelos distribuidos a lo largo del eje z. Para validar los datos de PT y hacer que el sistema sea más universal, integramos PTM con métodos de PA, transmisión y fluorescencia mediante el uso de PTM confocal con módulos de microscopio de fluorescencia confocal y el mismo orificio para la selección espacial de haces de sonda y fluorescencia, así como PT-fluorescencia multimodal. agentes de contraste En particular, el módulo fluorescente se usó para adquirir autofluorescencia celular y fluorescencia inducida por láser del citoplasma y la membrana de glóbulos rojos infectados con P. yoelii 17X GFP+ (usando un canal de 575/15 nm con láser de excitación de 532 nm).

En este estudio se utilizó un SEM JSM-7000F (JEOL USA, Peabody, MA) con un cañón de electrones de emisión de campo, equipado con un sistema EDS (EDAX Inc, Mahwah, NJ). Para las imágenes SEM, se utilizaron dos métodos de preparación de muestras: 1) polvo seco de cristales de Hz suspendidos en solución de etanol. Se depositaron unas pocas gotas de la suspensión en un disco de aluminio de 12,2 (diámetro) × 10 mm (grosor) (Ted Pella, Inc, Redding, CA), y 2) se roció el mismo polvo seco en un TEM perforado recubierto de carbono. (Suministros SPI, West Chester, PA). Las imágenes TEM fueron recolectadas por un JEM-2100F con un cañón de electrones de emisión de campo (JEOL USA, Peabody, MA), que también estaba equipado con un sistema EDAX EDS. Los cristales de Hz se suspendieron en etanol y se dispersaron cuidadosamente mediante agitación suave. Se depositaron unas pocas gotas de suspensión Hz en rejillas TEM de cobre de malla 200 recubiertas de carbono perforadas (SPI Supplies, West Chester, PA). Estas rejillas se secaron durante una hora antes del análisis TEM.

Los animales se usaron de acuerdo con un protocolo aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS). Los ratones hembra C57BL/6 y Foxn1(nu/nu) (The Jackson Laboratory, Inc.) se infectaron con 105 glóbulos rojos parasitados Plasmodium yoelii 17XNL GFP+ en estadio sanguíneo mediante inyección intraperitoneal. Se usaron ratones C57BL/6 no infectados como controles negativos. Durante los experimentos, los ratones se anestesiaron mediante la inhalación de isoflurano al 1,2 % y se colocaron boca arriba en un escenario calentado a 37 °C para el control in vivo. Los vasos elegidos para el estudio tenían aproximadamente 50 a 70 µm de diámetro a una profundidad de 150 a 200 µm en la oreja del ratón. Los transductores y las puntas ópticas se colocaron suavemente sobre la piel en el punto de detección y se ajustaron en tiempo real mediante la optimización de las alineaciones para obtener señales PA máximas y estables. Se usó gel de ultrasonido (Aquasonic Clear, Parker Labs, Inc.) para el acoplamiento acústico entre el transductor y la piel. Se recogió sangre de ratón de los vasos sanguíneos de la cola para realizar pruebas in vitro mediante tinción con Giemsa de frotis de sangre finos y microscopía de fluorescencia. Para PAFFC (arriba), recolectamos sangre de la arteria ventral y la vena lateral de la cola en ratones anestesiados usando una aguja 28G y una jeringa de 1 cc con citrato de sodio como anticoagulante. Se prepararon frotis de sangre y luego se examinaron en portaobjetos de vidrio utilizando muestras de sangre recolectadas de ratones sanos e infectados, se fijaron con metanol al 100 % y se secaron al aire. Los ratones se infectaron con los parásitos que expresaban GFP, mientras que los ratones no infectados sirvieron como control. Se analizó el número de señales de PA por segundo para estimar la etapa del parásito sanguíneo.

En experimentos seleccionados, se utilizó sangre humana de voluntarios de acuerdo con los protocolos aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Yale. El consentimiento informado se obtuvo de todos los temas. Todos los métodos se realizaron de acuerdo con las directrices y normativas pertinentes. El estudio se llevó a cabo de conformidad con las directrices ARRIVE.

La detección de PA in vitro de objetos absorbentes de luz que fluyen se realizó en un fantasma de vaso de flujo sanguíneo dinámico construido internamente38,39. Este consistía en plastisol de cloruro de polivinilo con nanopartículas de TiO2 que modelan biotejido con adecuadas propiedades de dispersión y absorción, una capa de melanina que representa la piel pigmentada, tubos de vidrio y plástico con diferentes diámetros y profundidades, y un módulo de flujo para bombear objetos en movimiento con velocidades entre 0,5 y 5 cm. /s. En particular, un tubo de vidrio cilíndrico con un diámetro de 0,78 mm (Sutter Instrument, BF100-78–10) que actúa como un vaso sanguíneo con una profundidad de 0,5 a 2 mm modeló la aplicación médica típica de PAFC. Para imitar el flujo de células y partículas, utilizamos 1) perlas magnéticas con diferentes tamaños y absorción específica en el rango NIR (Fig. 1c); 2) CBC rojos que representan agregados de RBC en sangre; 3) perlas de sílice transparente de 100 µm como fantasmas de CBC blancos; 4 agregados ICG que absorben preferentemente a 808 nm; y 5) Hz comercialmente disponibles. Específicamente, la suspensión sintética de Hz en solución de PBS a concentraciones de 10 μg/mL, 1,0 μg/mL y 0,1 μg/mL se usó como el fantasma de la piel pigmentada y los iRBC. La suspensión de Hz en PBS se derivó de una suspensión madre de 5 mg/ml mediante la adición de 1 ml de PBS a 5 mg de cristales de Hz en su vial original según las indicaciones del fabricante (Invivo Gen). Para calibrar el sistema PAFC, también se controló la traza después de la administración de perlas magnéticas (Spherotech Inc.) con diferentes diámetros medios. Se suspendió el mismo volumen (2 µl) de suspensión de perlas magnéticas (1 % p/v de diferentes distribuciones de tamaño medio de partícula: 5,25 µm, 8,22 µm y 23,7 µm) en 8 ml de PBS.

Estudios murinos. Usando la plataforma PAFFC, intentamos la detección temprana de Hz nativos ex vivo con la especie de roedor no letal Plasmodium P. yoelii 17XNL (MR4, BEI Resources Repository). Para proporcionar una verificación secundaria de la detección de Hz en tiempo real ex vivo, se utilizó una línea de parásitos marcada con proteína fluorescente verde (GFP) (P. yoelii 17XNL: PyGFP), lo que permitió la utilización de un canal fluorescente en la plataforma PAFFC. La sangre infectada de un ratón Foxn1 (nu/nu) obtenida 3 a 4 h después de la infección se analizó simultáneamente con el procedimiento PAFFC y mediante examen microscópico de frotis de sangre delgados. Específicamente, se diluyeron 100 µL de una muestra de sangre infectada con GFP+ P. yoelli en 100 µL de medio RPMI 1640 en un tubo con heparina. Una muestra de 1 µL de esta solución se diluyó en serie en PBS en las siguientes proporciones 1:102, 1:103, 1:104 y 1:105, y cada muestra diluida se analizó mediante PAFFC con un láser pulsado a 671 nm para Excitación PA y un láser CW a 473 nm para excitación de fluorescencia.

Las muestras congeladas de P. falciparum (cepa de laboratorio 3D7) se descongelaron utilizando un procedimiento salino de varios pasos (BEI Resources, Manassas, VA). Las placas de P. falciparum se mantuvieron en cultivo continuo al 2% de hematocrito con eritrocitos humanos y se incubaron a 37 °C en medio RPMI 1640 suplementado en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono y 1% de oxígeno. Una vez que los cultivos de parásitos alcanzaron > 5 % de parasitemia, se sincronizaron con una solución de sorbitol al 5 % para incluir solo parásitos en etapa anular de 0 a 12 horas después de la infección. Estas placas de cultivo se monitorearon hasta que los parásitos alcanzaron la etapa de esquizonte tardío, momento en el cual se usó un gradiente de Percoll al 60% para separar los parásitos en etapa de esquizonte. Los parásitos esquizontes recogidos se reintrodujeron en una nueva placa de cultivo con eritrocitos humanos no infectados y se dejaron incubar durante 4 h. Estos cultivos de P. falciparum se sincronizaron con una solución de sorbitol al 5% para crear placas que contenían parásitos en etapa anular solo de 0 a 4 horas después de la infección. Los cultivos de P. falciparum sincronizados se monitorearon durante las siguientes 48 h con un muestreo en serie del cultivo cada 6 h para preparar portaobjetos de microscopía de frotis de sangre finos y gruesos para el análisis. Se tomaron nueve muestras en total de los cultivos sincronizados, incluidos los siguientes puntos de tiempo después de la infección de eritrocitos: 0–4 h, 6–10 h, 12–16 h, 18–22 h, 24–28 h, 30–34 h, 36 –40 h, 42–46 h y 48–52 h.

Los ratones fueron monitoreados in vivo cada 1 a 3 días de 10 min a 1 h, dependiendo de la etapa de parasitemia. La tasa de señal PA se calculó como el número de señales por unidad de tiempo (segundo o minuto). Para igualar las variaciones de datos debidas al tamaño de los vasos, la posición del seguimiento diario y la individualidad del ratón, se seleccionaron y usaron vasos similares con un diámetro de ~ 50 µm en la oreja del ratón. A continuación, se rastrearon las amplitudes de pico a pico de las formas de onda de PA, y los puntos al menos 3σ por encima de los niveles de fondo se consideraron como señales de PA. Todas las mediciones se realizaron al menos tres veces, y los promedios de todos estos puntos de datos se trazaron en las figuras. Los datos recopilados (recuentos M) se representaron como M ± SD. Los análisis estadísticos y de señales se realizaron en MATLAB (MathWorks, Inc.). Se calculó el promedio de los datos recopilados con barras de error estándar y se empleó un nivel de significancia de α = 0,05 para la comparación.

Todos los datos asociados con este estudio están presentes en el documento o en los Materiales complementarios.

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado en parte por los fondos de dotación de la UAMS. Agradecemos a I. Pelivanov (Univ. de Washington) por proporcionar los transductores esféricos y cilíndricos enfocados personalizados. Agradecemos a Amy Bei (Escuela de Salud Pública de Yale) por su asistencia con los protocolos de cultivo y sincronización de P. falciparum. La cepa 17XNL:PyGPF de Plasmodium yoelii se obtuvo a través de BEI Resources, NIAID, NIH, MRA-817, aportada por Ana Rodríguez. Agradecemos a Sergey Nikitin por ayudar con las pruebas iniciales de los diodos láser. La mayor parte del trabajo experimental se realizó en la UAMS y en parte en la Universidad de Yale. Después de realizar este trabajo, HJJ se trasladó al Departamento de Física de la Universidad de Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, Irak.

Los siguientes autores contribuyeron por igual: Hind J. Jawad y Aayire C. Yadem.

Estos autores supervisaron conjuntamente este trabajo: Sunil Parikh y Vladimir P. Zharov.

Centro de Ciencias Integrativas de Nanotecnología, Universidad de Arkansas en Little Rock, 2801 S. University Ave., Little Rock, AR, 72204, EE. UU.

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Fumiya Watanabe y Alexandru S. Biris

Centro de Nanomedicina de Arkansas, Universidad de Ciencias Médicas de Arkansas, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, EE. UU.

Hind J. Jawad, Aayire C. Yadem, Yulian A. Menyaev, Mustafa Sarimollaoglu, Dmitry Nedosekin y Vladimir P. Zharov

Departamento de Física, Universidad de Bagdad, Al-Jadriya, Bagdad, 10071, Irak

Hind J. Jawad

Escuela de Salud Pública de Yale, 60 College St, New Haven, CT, 06520, EE. UU.

jillian n. armstrong y sunil parikh

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas, 4301 W. Markham St., Little Rock, AR, 72205, EE. UU.

Jason S. Stumhofer

Facultad de Medicina, Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas, Little Rock, AR, 72205, EE. UU.

Dmitri Nedosekin

Departamento de Otorrinolaringología, Facultad de Medicina, Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas, Little Rock, AR, 72205, EE. UU.

James Y. Suen & Vladimir P. Zharov

CytoAstra, LLC, 401 South Cedar St., Little Rock, AR, 72205, EE. UU.

James Y. Suen & Vladimir P. Zharov

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VPZ diseñó el estudio y escribió el documento; HJJ, ACY, YAM y JYU desarrollaron plataformas técnicas; MS desarrolló software y procesamiento de señales; HJJ, ACY, YAM realizaron un estudio relacionado con PA; ACY y DN realizaron estudio relacionado con PT; JSS proporcionó un modelo animal de malaria, JNA y SP proporcionaron muestras relevantes para humanos y evaluaciones asociadas; FW y ASB realizaron la caracterización de las muestras; SP editó el artículo. Todos los autores leyeron y aceptaron la versión final del artículo.

Correspondencia a Vladimir P. Zharov.

VPZ, JYS y UAMS tienen un interés financiero en la tecnología que se analiza en esta publicación. VPZ y JYS tienen intereses financieros en CytoAstra, LLC, que obtuvo la licencia de la tecnología presentada en este trabajo de investigación. Estos intereses financieros han sido revisados ​​y aprobados de acuerdo con las políticas de conflicto de intereses de UAMS. Los otros autores no tienen ningún conflicto de intereses relacionado con este manuscrito.

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Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Jawad, HJ, Yadem, AC, Menyaev, YA et al. Hacia el citófono portátil Rainbow con diodos láser para el diagnóstico global de enfermedades. Informe científico 12, 8671 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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Recibido: 06 Octubre 2021

Aceptado: 18 abril 2022

Publicado: 23 mayo 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11452-w

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